大家好，本周为大家分享一篇发表在Anal. Chem.上的文章：Comprehensive Metabolomic Analysis of Human Heart Tissue Enabled by Parallel Metabolite Extraction and High-Resolution Mass Spectrometry[1]，文章的通讯作者是威斯康星大学麦迪逊分校的葛瑛教授。
心脏收缩需要持续的能量供应。作为一种“代谢杂食动物”，心脏利用多种代谢底物，如脂肪酸、碳水化合物、脂质和氨基酸等，来满足其高能量需求。然而，由于代谢物在极性尺度上具有广泛的覆盖范围，这使得它的提取和检测变得困难。因此，迫切需要对心脏的代谢产物进行全面的组学分析。本研究结合了平行代谢物提取和互补高分辨质谱检测的方法，对人类心脏进行了系统性代谢组学分析。作者首先用六种提取方法获得了健康供体心脏组织的代谢物，包括三种单相提取，两次双相提取和一次三相提取，可以充分覆盖不同极性范围的代谢物。其中，单相的提取溶剂分别是100% 甲醇、80% MeOH 和乙腈/异丙醇/水（3:3:2），双相使用了Matyash和Bligh & Dyer法去萃取极性和非极性相，而三相则是进一步将非极性相分离成极性和中性脂质相，极性物质依然保留在水相中。紧接着，作者使用了两种互补的质谱平台进行代谢物检测：超高分辨傅里叶变换离子回旋共振质谱的直接进样（DI-FTICR）和高分辨率液相色谱四极杆飞行时间串联质谱（LC-Q-TOF-MS/MS）。总的实验流程如图1所示。这里总共鉴定到了1340种心脏代谢物，它们具有广泛的极性范围。本工作强调了平行提取和互补质谱检测技术在人类心脏代谢组研究中的重要性，其可作为帮助选择适当的提取和MS方法以研究特定类别代谢物的指南。
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图1. 平行代谢物提取和高分辨率质谱检测的实验流程图。
为了捕获不同极性的代谢物，作者使用了六种提取方法获得了心脏组织的代谢物。单相法具有操作简便和通量较高的特点，但提取效率仍待提高。相对于单相法，多相提取可以覆盖更广泛极性范围的代谢物，但也需要注意一些代谢物可能在多相中分布，这会给检测和定量带来困难。比如，脂肪酰基链较短的酰基肉碱主要在极性相中存在，而较长链（＞C10）的酰基肉碱主要在非极性相中存在。DI-FTICR评估了六种提取方法的重现性，结果发现乙腈/异丙醇/水（3:3:2）在单相法中的重现性最好，两种双相法的重现性类似，但低相的Pearson相关性较低，说明了代谢物在跨相运动中有一定潜在困难。研究也发现不同提取方法均具有各自的提取特征，尤其在三相法中可以观察到更多的特征，它在极性相、极性脂质相和非极性脂质相中分别观察到了2275、541 和 443 个独特的SmartFormula注释。图2展示了六种方法通过DI-FTICR得到的代谢物SmartFormula注释，其中最大的三个交叉区域分别是六种方法共享、三相法特有和乙腈/异丙醇/水（3:3:2）特有的，分别有1287个、1010和703个，且发现多相提取的重叠度会更高。虽然在三相提取中可以获得更多的代谢特征，但该方法的重现性也最低。故对于发现代谢组学实验，Matyash提取法会更具优势，因为它可以鉴定到较多的已知代谢物，且重现性会更好。图2. 六种提取方法间代谢物SmartFormula注释的重叠情况（DI-FTICR）。借助DI-FTICR平台，总共鉴定到9644个代谢特征，其中可以7156和1107个可以分配到SmartFormula注释和准确质量数。DI-FTICR在代谢物检测和鉴定方面具有强大优势，它可以给出准确的同位素分布，如图3B~3D所示。但需要注意的是，由于缺乏前端色谱分离，DI-FTICR对于异构体的分离检测能力有限，以及缺乏高通量的MS/MS分析。因此，作者利用LC-Q-TOF-MS/MS补齐了DI-FTICR检测平台的缺点。在LC-Q-TOF-MS/MS分析中，总共鉴定到21428个代谢特征，其中285个可通过比对二级谱图数据库来匹配确定。图4是鉴定到的代谢物和脂质。尽管与图3B~3C的酰基链组成相同，但在图4B~4C中可以通过观察酰基链的碎裂谱图得到脂质的酰基链信息。这说明LC-Q-TOF-MS/MS平台在获取更详细的酰基链信息方面的优势，但对于双键定位以及 sn1 和 sn2 定位等信息，还需要额外的实验去确定（如：衍生化和离子淌度）。此外，仪器参数设置也会影响到二级匹配评分。总的来说，相对单一的质谱检测平台，使用DI-FTICR MS和LC-Q-TOF-MS/MS平台可以增加心脏代谢组的覆盖范围。图3.使用LC-Q-TOF-MS/MS鉴定代谢物。（A）代表性的MS 谱图（100%
MeOH），标注了SmartFormula注释和准确质量数，叠加实验质谱图（黑色）与理论质谱图（红色）以比较同位素分布；（C~D）FAHFA（40:5）、DG（32:0）和N-palmitoyl glutamic acid。图4.使用LC-Q-TOF-MS/MS鉴定代谢物，比较实验串联质谱图（黑色）与数据库质谱图（红色）。（A~D）N-acetyl-β-glucosaminylamine、DG（16:0_16:0）、FAHFA（18:1_22:4）和TG（18:1_18:1_18:2）。使用多种提取和检测方法，本研究总共鉴定到了1340种心脏代谢物。每种提取方法都贡献了唯一检测到的代谢物。相较于提取效果最好的单一方法，平行提取可以检测到额外的350种代谢物。单相法可以鉴定到更多与二级谱图相匹配的代谢物，而多相法可以得到更多具有准确质量数的代谢物（图5A）。如图5B所示，三相法富集到的代谢物种类最多，包含甘油磷酸乙醇胺（PE）、脂肪酸和偶联物、三酰基甘油、脂肪酸酯和其他代谢物。此外，Matyash法可以鉴定到更多的氨基酸、甘油磷酸甘油和甘油磷酸丝氨酸，B&D法可以鉴定到更多的甘油磷酸胆碱（PC）、和磷磷脂，而100% MeOH鉴定最多的则是甘油磷酸盐。图5.已鉴定的人类心脏代谢物汇总。（A）各种提取方法中的准确质量注释、MS/MS注释和唯一检测到的代谢物；（B）各种提取方法中前10的代谢物种类。最后，作者进一步表征了所有代谢物的化合物分类和通路富集，如图6所示。实验观察到很多代谢物归属于脂质和类脂分子，其中主要是PC、PE和脂肪酸，而非脂质化合物主要是有机酸及其衍生物（图6A）。通路分析也检测到了与心脏代谢过程相关的重要通路，包括嘌呤代谢和甘油磷脂代谢，如图6B所示。这里以嘌呤代谢（与多种心脏病变相关）为例，展示了平行提取在提高代谢物覆盖率方面的优势。在嘌呤代谢过程中，只有IDP仅在单一提取方法中观察到，而许多代谢物均在所有六种提取方法中都被检测到（图6C）。值得注意的是，B&D提取法在该过程中观察到了最多的代谢物，而100% MeOH富集的最少。上述结果为选择适当的用于分析人类心脏代谢物的提取方法提供了重要见解。图6.已鉴定的人类心脏代谢物的化合物分类和通路富集。（A）化合物分类；（B）所有已鉴定代谢物的通路分析汇总，每个圆圈的颜色和大小分别基于p值和通路影响值（红色表示影响大，黄色则相反）；（C）嘌呤代谢过程，颜色表示鉴定代谢物的提取方法。总的来说，本研究利用六种平行代谢物提取的方法和两种基于质谱检测平台，对人类心脏进行了全面的代谢组学分析，总共鉴定到1340种心脏代谢物，这代表了迄今为止对人类心脏代谢组学的最深度覆盖。研究发现三相法最适合脂质的提取，它获得的极性代谢物的数量与Matyash法相似，但其实验重现性也最低。因此，提取方法的选择应当取决于感兴趣的待分析物。但对于非靶向研究，作者建议使用Matyash提取法，以实现代谢组覆盖率和重现性的最佳平衡。尽管本研究目前还存在一定的局限性，比如，平行提取样品量较大和分析时间较长，但其为选择适当的提取和质谱检测平台去分析不同类型的心脏代谢物提供了宝贵经验，有助于人类心脏代谢组学的全面分析。文章引用：Comprehensive
Metabolomic Analysis of Human Heart Tissue Enabled by Parallel Metabolite
Extraction and High-Resolution Mass Spectrometry
www.x-mol.com/groups/li_huilin
参考文献![]()
Wancewicz
B, Pergande MR, Zhu Y, et al. Comprehensive Metabolomic Analysis of Human Heart
Tissue Enabled by Parallel Metabolite Extraction and High-Resolution Mass
Spectrometry. Anal Chem. 2024;96(15):5781-5789.
doi:10.1021/acs.analchem.3c04353
