大家好，今天给大家分享一篇发表在Advanced Science上的文章，题目是Targeted Analysis of Mitochondrial Protein Conformations and Interactions by Endogenous ROS-Triggered Cross-Linker Release1，文章的通讯作者是中国科学院大连化学物理研究所的张丽华、杨开广研究员。
线粒体作为细胞的“动力工厂”，在细胞代谢途径中扮演着重要的角色，如氧化磷酸化(OXPHOS)和三羧酸(TCA)循环。线粒体蛋白质的功能失调与多种疾病相关，包括代谢紊乱和神经性疾病。而蛋白质的功能很大程度上取决于其三维结构和蛋白质-蛋白质相互作用(PPIs)，因此，全面研究线粒体蛋白质构象和PPI对于理解蛋白质功能和调控机制至关重要。化学交联质谱（CX-MS）是一种用于分析蛋白质结构和蛋白质-蛋白质相互作用的重要技术，其原理是利用化学交联剂处理蛋白质样品，将空间距离足够接近、可以与交联剂反应的两个氨基酸以共价键连接起来，然后利用基于高精度质谱的蛋白质组学手段分析交联产物。CX-MS能够同时对复杂样品进行大规模构象和PPI分析，该优势使其能够保留线粒体的完整性并实现线粒体蛋白质分析。然而，该方法目前仍存在一些缺陷，例如从活细胞天然生理微环境中分离的线粒体纯度有限，影响了交联结果的准确性。此外，剥离线粒体还可能会导致不可逆的扰动，导致线粒体内蛋白质构象和PPI的改变或丢失。
图1 R-CDNP 技术用于分析完整活细胞中天然线粒体蛋白构象和相互作用的过程示意图。
在这篇文章中，研究者基于该课题组创立的载体交联技术（CD-MS），通过乳液溶剂扩散法构建了内源性ROS 响应型交联剂纳米颗粒 （R-CDNP），用于将交联剂 DSS 递送到活细胞中的线粒体。DSS 可被内源性 ROS 触发从R-CDNP 释放，从而实现线粒体蛋白质的原位交联，随后进行纳流LC-MS/MS 分析，最终实现对HepG2活细胞中线粒体蛋白的原位构象和 PPI 分析（图 1）。
图2 R-CDNP 的表征。A）R-CDNP 的 TEM 图像（比例尺 = 100 nm）。B） HepG2 细胞与香豆素 6 标记的 R-CDNP 孵育 3 小时后的CLSM 图像。C） R-CDNP 在不同浓度H2O2 中处理7小时后的 Zeta 电位变化。D） R-CDNP在不同 H2O2浓度下处理24小时后的直径变化。E） HepG2 细胞在不同浓度的R-CDNP下处理 7 小时后的活力。F） HepG2 细胞蛋白质组学变化的箱式图。
作者对制备的R-CDNP进行了系统的特性评估，全面地展示了R-CDNP的物理化学特性、线粒体靶向能力、ROS响应性以及生物相容性（图2），均证明R-CDNP有较好的稳定性与特异性。
图3 HepG2 细胞的交联线粒体蛋白质组。A）映射到 PDB 数据库后已被识别的交联 Cα-Cα 距离分布。B）属于STRING 数据库的已识别 PPI 的分数分布。C）线粒体中不同亚细胞器之间的相互作用网络。
作者将R-CDNP与HepG2 细胞进行孵育以评估纳米颗粒在活细胞线粒体中的释放与线粒体蛋白组的鉴定情况。通过R-CDNP技术，作者在HepG2细胞中鉴定了572个线粒体蛋白的2103个交联位点，其中包括1718个内源性交联位点和385个蛋白质间交联位点。在严格卡值标准下（1% FDR, PSM≥2），交联蛋白覆盖了构建的线粒体蛋白质组数据库的 32.10%，实现了线粒体蛋白的深度覆盖。图3A首先展示了将鉴定的交联映射到PDB数据库结构时，Cα-Cα距离的分布情况，图中显示大多数交联均在DSS的最大距离限制（30 Å）内，表明这些交联的可靠性。所鉴定的PPI在STRING数据库中的得分分布也主要集中于高分区域，表示这些PPIs的可靠性较高（图3B）。基于以上鉴定的结果，作者构建了一个包括不同线粒体蛋白质组的相互作用网络，其中包括OXPHOS复合体、膜蛋白、基质蛋白和分子伴侣等（图3C）。
图4 OXPHOS 复合物之间的交联信息。A） OXPHOS 复合物之间交互网络。B）OXPHOS CII的交联信息。C）OXPHOS超大蛋白质复合物CI-CIII2-CIV 上的交联信息。D）OXPHOS CV上的交联信息。
OXPHOS 是一种重要的代谢途径，释放的能量用于产生 ATP，这是线粒体的重要标志物。图4主要展示了OXPHOS复合物的交联信息。研究者首先展示了OXPHOS复合物各亚基之间的相互作用，包括已知的和新发现的相互作用（图4A）。接着，研究者将鉴定的交联映射到OXPHOS复合体的各个组分上。通过这些交联信息，研究者能够捕捉到OXPHOS复合体亚基之间的动态相互作用，这对于理解其功能和调控机制至关重要，为理解线粒体呼吸链的蛋白质组装、功能和动态变化提供了重要信息。
图5 具有 ATP 依赖性构象循环的伴侣蛋白的交联信息。A） 线粒体伴侣复合物。B）人类应激70蛋白。C）热休克70 kDa蛋白1A。
分子伴侣是一种动态分子机器，有助于线粒体蛋白质的正确折叠和组装，并维持线粒体稳态。图5主要展示了与分子伴侣蛋白相关的交联信息，特别是那些具有ATP依赖性构象循环的分子伴侣，包括HSP60和HSP10构成的线粒体分子伴侣复合物、人类应激70蛋白（HSPA9）的NBD（N端核苷结合域）和SBD（C端底物结合域）、热休克70 kDa蛋白1A（HSPA1A）与90 kDa热休克蛋白（HSP90）形成的复合物。通过展示分子伴侣蛋白的交联数据，揭示了这些蛋白在底物结合和解离过程中可能发生的开闭构象转变，以及它们在ATP依赖性构象循环中的动态相互作用，这对于理解线粒体蛋白质的折叠、组装和功能至关重要。
总的来说，这篇文章开发了一种名为R-CDNP的纳米颗粒，它能够靶向线粒体并在内源型ROS触发下释放交联剂DSS。通过ROS触发的DSS释放，研究者显著提高了载体交联技术的可控释放性、进而提高了其在线粒体蛋白质分析中的交联覆盖率、生物友好性，这有助于我们更深入、更原位的理解线粒体蛋白的生物功能，为线粒体疾病的治疗提供新的视角。
撰稿：梁梓欣
编辑：李惠琳
文章引用：Targeted Analysis of Mitochondrial Protein Conformations and Interactions by Endogenous ROS-Triggered Cross-Linker Release
Zhou W, Chen Y, Fu W, Li X, Xia Y, Zhao Q, Zhao B, Zhang Y, Yang K, Zhang L. Targeted Analysis of Mitochondrial Protein Conformations and Interactions by Endogenous ROS-Triggered Cross-Linker Release. Adv Sci (Weinh). 2024 Oct 30:e2408462.
