Anal. Chem.｜循环离子迁移-质谱和串联碰撞诱导去折叠技术用于定量难以捉摸的蛋白质生物标志物

细胞内蛋白形态的表达水平与人类疾病之间存在密切的联系。帕金森病（PD）是世界上最常见的神经退行性疾病之一，其病理特征包括多巴胺能神经元的丧失和Lewy小体的堆积，主要由α-突触核蛋白（α-syn）组成。尽管α-syn被认为是PD的潜在生物标志物和治疗靶点，但目前对其结构蛋白形态的认识仍然不足。在这篇文章中，研究者开发了一种循环离子迁移-质谱（cIM-MS）方法，结合碰撞诱导去折叠（CIU）技术，能够量化α-syn的不同变体。他们展示了CIU²技术相比传统的CIU¹技术在区分α-syn的野生型和突变型（E46K）方面具有更高的灵敏度和更低的检测限。最后，他们开发了一个完全自动化的定量CIU²工作流程，可以直接从人工脑脊液(aCSF)中确定三种与疾病相关的α-syn变体的相对量。这项研究表明，CIU可以作为一种量化的质谱技术，用于测量使用传统的量化质谱技术难以区分的蛋白质形态。这一方法有望在临床研究中提供有关不同α-syn蛋白形态在PD发展中作用的见解，并为基于结构的诊断和治疗干预铺平道路。

图1 CIU²实验的工作流程。（A）WT α-syn的6+、7+、8+电荷态的CIU ¹指纹图谱。(B)用于比较CIU数据的RMSD图示例。(C) cIM-MS仪器对CIU² 实验重要的区域。(D) WT α-syn的7+ CIU¹指纹图谱特征检测。(E)在20 V CIU 1 碰撞能量下，在56 ~ 58 ms范围内选取7+离子，对WT α-syn CIU² 指纹图谱进行特征检测。(D)和(E)中的到达时间轴对齐，以便直接比较CIU¹ 和CIU² 数据。

    代表WT α-syn的6+、7+、8+电荷态的CIU¹ 指纹图谱如图1A所示。由于6+离子仅经历了一次CIU¹展开转变，限制了蛋白间可比较的状态数，而8+离子通过瞬态CIU¹中间体展开，可能会影响后续定量分析的可重复性，因此最终选择了7+电荷态对WT和变体α-syn进行比较。

图2 使用CIU¹定量WT和E46K α-syn。(A) WT和E46K α-syn的7+电荷态的质谱叠加。(B) WT α-syn 7+电荷态CIU¹指纹图谱。(C) E46K α-syn的7+电荷态CIU¹指纹图谱。(D)图（B、C）中CIU¹ 指纹图谱对比图。(E)图（B、C）中CIU¹数据在40 V激活下提取的IM谱图叠加。(F)通过将图（E）中第二个峰的面积绘制为含有WT和E46K α-syn的混合物中WT含量的函数而生成的校准曲线。误差棒表示三个技术重复的标准偏差。

    WT和E46K α-syn的分子量仅相差1 Da，因此仅用质谱很难区分(图2A)。然而，当激活这两种蛋白质形态并施加CIU¹ 时，观察到显著差异。图2B、2C分别为WT和E46K α-syn的CIU¹ 指纹图谱。40 V激活时的过渡区使WT和E46K IM谱图之间出现最显著的差异（图2E）。

图3 使用CIU²定量WT和E46K α-syn。(A)WT α-syn的7+电荷态的CIU²指纹图谱，由离子阱中40 V激活的64 ~ 66 ms范围内的离子生成。(B) E46K α-syn的7+电荷态的CIU²指纹图谱，由离子阱中40 V激活的64 ~ 66 ms范围内的离子生成。(C)图中CIU²指纹图谱(A, B)的对比图。(D)图中指纹图谱(A, B)在55 V的额外激活电压下提取的IM谱图叠加。(E)将图(D)中第一个峰的面积绘制为含有WT和E46K α-syn的混合物中E46K含量的函数所生成的校准曲线。误差棒表示三个技术重复的标准偏差。

    尽管从CIU¹ 数据中获得了定量信息，但作者希望利用α-syn 的CIU² 数据（图1E）中观察到的附加特征进一步区分WT和E46K α-syn，提高定量分析水平。选择WT和E46K α-syn之间差异最大的区域进行CIU²分析。图3A、3B显示了在选择64 ~ 66 ms范围内的离子时，WT和E46K α-syn的CIU² 指纹图谱。图3C显示了WT与图3A,3B中E46K α-syn CIU² 指纹图谱的RMSD图。在55v的额外回注能量下，观察到的转变最具差异性（图3D）。与图2F中由CIU¹ 数据生成的校准曲线相比，通过积分图3D中的峰1进行定量CIU² 分析，灵敏度提高了2倍。在检出限方面，CIU¹ 方法的检出率最低为13.5% (675 nM)，而CIU² 方法的检出率最低为3.9% (195 nM)，提高了3.5倍。当CIU² 时，校准的线性度也得到了改善，这可能是由于原始数据中的信噪比得到了改善。总的来说，这突出了CIU² 分析在进一步区分密切相关蛋白和改进基于构象的定量分析方面的实用性。

图4 CIU²定量aCSF中的α-syn变异。(A) 20 nM α-syn预富集和未预富集的质谱叠加。(B) aCSF中WT α-syn的SEC分离得到的总离子色谱图。(C)在图3中用于定量的CIU²条件下，使用在线SEC获得的WT和E46K α-syn的IM谱图叠加。(D)将图(C)中第一个峰的面积绘制为含有WT和E46K α-syn的混合物中E46K含量的函数所生成的校准曲线。(E)将图S3中第一个峰的面积绘制为含有WT和A53T α-syn的混合物中A53T含量的函数所生成的校准曲线。(F)将图S3中第一个峰的面积与第二个峰的面积之比绘制为pS129 WT在同时含有WT和pS129 WT α-syn的混合物中含量的函数所生成的校准曲线。误差棒表示三个技术重复的标准偏差。

    为了进一步验证定量CIU²实验，作者定量分析了WT和几种直接来自aCSF的α-syn疾病相关变异。先前的研究报道α-syn的生理水平差异很大。作者首先制备了20 nM (α-syn总浓度)的样品，但由于浓度过低未被检测到质谱信号。因此，作者使用离心预浓缩器将5 ml体积的样品富集到nESI可检测的水平(1 μM终浓度)。图4A显示了对100 mM 醋酸铵中20 nM WT α-syn样品进行预浓缩和不进行预浓缩的质谱数据的比较，表明预浓缩是一种可行的方法，可以从临床相关体积的样品中检测生理水平的α-syn。

    虽然已经证明可以从质谱兼容的醋酸铵溶液中获得α-syn变异的定量信息，但生物基质中，例如aCSF中，通常含有抑制α-syn信号的非挥发性盐。因此，作者使用在线SEC分离与配备喷针的传统ESI源相结合，在CIU之前自动化样品导入和脱盐过程。经在线SEC预浓缩和脱盐后的IM谱图如图4C所示。对样品预富集和在线脱盐的CIU² 方法的定量精度进行了评价。将WT和E46K α-syn按不同比例(各混合物中α-syn总浓度为5 μM)混合在aCSF中制备一套标准品，直接进样进行在线SEC-CIU²分析。以相同的方法制备了两个“未知”样本，总α-syn为20 nM, E46K的比例为30%和50%。未知样本用于模拟携带E46K突变的生物体样本，其中WT和E46K α-syn共存。将初始体积为5ml的未知样本浓缩至约50 μL，然后用SEC-CIU²分析，方法与标准品相同。图4D为在线SEC-CIU²实验生成的WT和E46K α-syn校正曲线。未知样品的分析结果为校准曲线上的红色点。在线SEC-CIU²方法能够在制备比例的3%范围内测量E46K变体的相对丰度，对E46K突变体的检出限为4.4%。

    最后，作者将用于量化E46K变体的相同条件应用于其他两个与疾病有关的α-syn变体：A53T突变体和WT α-syn在第129条丝氨酸磷酸化的变体。虽然与E46K突变体相比，这些变异在分子量上表现出更大的差异，但生物样品中含有盐的加合物仍然会干扰未加合的蛋白质信号，即使采用脱盐步骤，也会使定量具有挑战性。因此制备了A53T和pS129 α-syn的标准品和未知品，并进行上述分析。图4E、4F为A53T和pS129 α-syn的分析结果。总体而言，这些结果表明CIU²分析可用于量化α-syn的疾病相关变异，而其他基于MS的方法难以区分这些变异。

    总而言之，这篇文章开发了一种cIM-MS支持的CIU²实验，可以实现多种迁移率选择和激活阶段，可以探测蛋白质结构的细微差异，并利用这些差异进行结构蛋白形态定量。在这里，CIU被用来获取溶液中存在的疾病相关α-syn蛋白形式的相对丰度的定量信息，这些信息很难用传统的标准方法区分。传统的CIU¹实验只有一个激活阶段，没有迁移率选择，可以提供一定的α-syn定量数据，而CIU²数据的定量则提高了校准的线性度、灵敏度和检出限。最终，这些结果证明了CIU作为定量质谱技术用于蛋白质生物标志物分析的实用性，可以用于分析在高阶结构中表现出细微差异的分析物。

撰稿：梁梓欣

编辑：李惠琳

文章引用：Cyclic Ion Mobility-Mass Spectrometry and Tandem Collision Induced Unfolding for Quantification of Elusive Protein Biomarkers

参考文献

1. Makey, D. M., Gadkari, V. V., Kennedy, R. T., & Ruotolo, B. T. (2024). Cyclic Ion Mobility-Mass Spectrometry and Tandem Collision Induced Unfolding for Quantification of Elusive Protein Biomarkers. Analytical Chemistry, 96(15), 6021-6029.