导读
DNA 疫苗能引发强烈的体液免疫和细胞介导的免疫反应，为治疗癌症和人类免疫缺陷病毒等快速变异疾病提供方案。这种疫苗技术已经存在了几十年，但到目前为止还没有一种 DNA 疫苗被用于临床应用。阻碍 DNA 疫苗进展并限制其临床应用的主要挑战是向靶向免疫细胞递送的障碍。
加拿大滑铁卢大学的研究人员在Pharmaceutics上发表题目为《Engineered Nanodelivery Systems to Improve DNA Vaccine Technologies》的文章，讨论了各种纳米递送系统，这些系统改进了 DNA 疫苗技术以增强针对目标疾病的免疫反应，并对如何将这种疫苗技术应用于临床提供了可能的观点。
一、DNA疫苗技术
DNA疫苗技术在治疗许多疾病如癌症、动脉粥样硬化和糖尿病方面均有着巨大潜力。DNA疫苗的作用是将蛋白质抗原编码到DNA中，再将其传递到细胞中以产生特定蛋白质。抗原呈递细胞（Antigen-Presenting Cells，APCs）对这些蛋白质进行加工，并将它们呈递给淋巴细胞。因此，DNA疫苗技术具有灵活、多功能的特点，能激发强烈的体液和细胞免疫反应，在为新出现的和流行性疾病爆发开发新疫苗方面具有巨大的未来应用潜力。但DNA疫苗仍存在向靶免疫细胞的递送障碍，包括细胞外和细胞内的多种屏障，如核酸酶降解、吞噬消除、细胞膜穿透、内体/溶酶体逃逸以及核膜转运等。DNA疫苗诱导抗原特异性免疫的机制明确了向APCs有效递送的必要性（图1），上述所有DNA递送障碍都会导致基因转染减少，并最终导致治疗效果不佳。
图1 DNA疫苗诱导抗原特异性免疫的机制
二、DNA疫苗技术克服递送障碍的方法
多种技术可促进质粒DNA向细胞的递送以增强免疫反应，包括机械及非机械递送，其中机械递送包括电穿孔、无针气动或喷射注射器、基因枪等。电穿孔通过传递电脉冲来诱导细胞膜暂时且可逆的通透性，尽管操作简便且快速，但其高电压会导致大量细胞死亡。无针气动或喷射注射器，其通过利用加压腔将含有质粒DNA的溶液强力注入皮肤或肌肉组织，无针技术实现高效且无痛的药物递送，但通常配合昂贵且复杂的设备并与静脉内递送不兼容[2]。另外基因枪使用加压气体对涂有质粒DNA的重金属颗粒进行物理轰击，能高效地将DNA递送至靶细胞，但轰击颗粒的高速可能导致细胞损伤并且基因枪系统价格昂贵。非机械递送方法如病毒载体和非病毒载体，由于病毒载体存在包括免疫原性、恢复毒性以及插入突变等病毒安全性问题，因此非病毒载体，尤其是纳米载体和佐剂的设计成为研究热点。
三、纳米技术应对DNA疫苗递送挑战
作为递送载体的纳米粒子（NPs，Nanoparticles）可保护有效载荷在运输到靶细胞过程中免受降解。纳米粒子递送系统能够提高DNA有效载荷的免疫原性，将毒性降至最低，增强DNA摄取和进入细胞核的能力并改善整体的抗原特异性免疫反应。
聚合物纳米粒子
聚合物纳米粒子由于其良好的安全性、多功能性以及增强免疫反应的能力。用于DNA疫苗递送的最常见聚合物纳米粒子包括壳聚糖、聚乳酸（Poly(LacticAcid)，PLA）、聚谷氨酸（Poly(GlutamicAcid)，PGA）和聚乳酸-羟基乙酸共聚物（Poly(Lactic-co-GlycolicAcid)，PLGA）（图2）。
图2 用于DNA疫苗递送的聚合物材料的化学结构
壳聚糖是一种生物相容性好、可生物降解、毒性极低的聚合物，适用于对DNA疫苗递送，其能够与DNA的阴离子结构进行静电结合，形成聚合物-DNA复合物保护DNA免受酶的降解。PLGA具有可生物降解性、生物相容性和易于调节的物理性质，PLGA纳米粒子通过水解过程释放其有效载荷，有效载荷在突释时迅速扩散到周围环境中。聚乙烯亚胺（Polyethylenimine，PEI）具有通用性，高分子量的PEI会导致较高的转染效率以及较高的细胞毒性。研究表明利用涂有含PLGA/PEI纳米粒子的多聚复合物的微针开发了一种皮内pH1N1DNA疫苗递送系统（图3）。结果显示微针上涂覆的多聚复合物比肌肉内多聚复合物递送以及干涂微针递送的裸pH1N1DNA质粒诱导了更强的体液免疫反应[3]。聚乙二醇（Poly(Ethyleneglycol)，PEG）通常用于纳米粒子的表面功能化，屏蔽纳米粒子的表面电荷并提供空间稳定。综上聚合物纳米材料由于其在组成和分子量方面的多功能性而具有广泛的功能，但它们提供的有限转染效率限制了它们在临床试验及其他方面的广泛采用和进展。
图3用于皮内接种的PLGA/PEI/pH1NI
多聚复合物涂层微针示意图
脂质纳米粒子
脂质体具有高转染和包封效率以及易于调节的表面性质[4]。影响脂质体向临床研究过渡的阻碍包括毒性、非特异性免疫原性、在循环中的不稳定性以及从体内的快速清除。研究表明，通过用脂质体递送编码黑色素瘤的DNA对自体树突状细胞（DCs）进行体外转染，证明了对黑色素瘤的长期保护性免疫的显著诱导（图4）。
图4黑色素瘤DNA疫苗体外
转染DCs的长期保护性免疫
混合脂质-聚合物纳米粒子
将聚合物材料和基于脂质的递送系统这两种技术结合起来，这种递送系统被称为脂质-聚合物复合物（Lipopolyplex），脂质-聚合物复合物的设计结合了聚合物和脂质体材料的协同优势，与仅使用其中一种材料的其他平台相比，具有更高的转染效率和更低的细胞毒性[5]。
无机纳米粒子
无机纳米材料具有易于功能化、生物相容性以及明确的化学性质。其中金（Au）纳米粒子具有明确且多样的表面化学性质、易于制造以及良好的生物相容性。能够降低毒性、增强免疫原性活性并在疫苗储存方面提供稳定性。铁纳米粒子具有低毒性、成本低廉、易于表面功能化以及能够结合生物材料等良好特性。超顺磁性氧化铁纳米粒子（Superparamagnetic Iron Oxide NPs，SPIONs）被广泛应用于药物递送领域。SPIONs的磁性使得可以利用外部磁场引导纳米粒子和结合的药物到达体内的目标区域和组织，从而实现治疗药物的精确控制积累。一种基于SPION的DNA疫苗递送系统用聚乙烯亚胺和透明质酸进行功能化，以提高载体的稳定性和对APC的靶向能力（图5）。
图5利用SPION的DNA疫苗递送系统
病毒样颗粒
病毒样颗粒（Virus-LikeParticles，VLPs）与病毒结构非常相似的颗粒，但不包含病毒遗传物质。病毒样颗粒具有良好的佐剂特性，能诱导先天性和适应性免疫反应，并具有形态均一、生物相容性好以及易于功能化的优点。
基于蛋白质的纳米粒子
基于肽的纳米载体具有固有的生物相容性、生物可降解性以及通常较低的细胞毒性，如如鱼精蛋白、明胶B-鱼精蛋白等。尽管蛋白质能够有效地结合小分子药物，但对DNA的负载能力低，缺乏细胞特异性，从而限制了在疫苗接种方面的整体有效性。鱼精蛋白是是一种阳离子蛋白质，其结构能有效地与质粒DNA复合，并具有几个核定位信号区域，可介导跨核膜运输。
四、DNA疫苗技术的临床试验
如今只有少数基于纳米材料的DNA疫苗递送系统成功进入临床试验阶段，但都未被批准使用[6]。当前的DNA疫苗技术能够诱导一定程度的特异性体液免疫和细胞介导免疫反应，但对于治疗相关性来说其强度还不够。DNA疫苗技术也可用于癌症免疫治疗，临床研究证明了DNA疫苗的安全性，显示出极小的不良反应以及能够诱导广泛特异性免疫反应的能力，但治疗效果甚微，阻碍了该疫苗技术的进展。
尽管在过去十年的疫苗研究中取得了乐观的进展，但对于许多疾病，如癌症、艾滋病、登革热、寨卡和基孔肯雅热，仍然没有商业可用的疫苗或有效的治疗方法，因此DNA疫苗成为填补这一空白的有希望的候选者。而DNA疫苗的主要挑战是在抗原呈递细胞内产生具有治疗相关性水平的外源蛋白表达，以刺激保护性的体液免疫和细胞介导免疫。基于纳米材料的递送系统取得了这些进展，但DNA疫苗在人体临床试验中的表现仍然不佳，未能产生强大的免疫原性反应。未来需要进一步研究，包括选择合适的抗原、联合治疗以及优化治疗方案等，以提高DNA疫苗的疗效。希望纳米递送系统继续改进，期望在不久的将来，两者都将变得更具临床相关性和治疗有效性。
参考文献
[1]Lim, Michael , et al. "Engineered Nanodelivery Systems to Improve DNA Vaccine Technologies." Pharmaceutics 12.1(2020):30.
[2]Kale, T.R.; Momin, M. Needle free injection technology-An overview. Innov. Pharm. 2014, 5, 192–199.
[3]Kim, N.W.; Lee, M.S.; Kim, K.R.; Lee, J.E.; Lee, K.; Park, J.S.; Matsumoto, Y.; Jo, D.G.; Lee, H.; Lee, D.S. Polyplex-releasing microneedles for enhanced cutaneous delivery of DNA vaccine. J. Control. Release 2014, 179, 11–17.
[4]Xiao, Y.; Shi, K.; Qu, Y.; Chu, B.; Qian, Z. Engineering nanoparticles for targeted delivery of nucleic acid therapeutics in tumor. Mol. Ther. Methods Clin. Dev. 2018.
[5]Rezaee, M.; Oskuee, R.K.; Nassirli, H.; Malaekeh-Nikouei, B. Progress in the development of lipopolyplexes as efficient non-viral gene delivery systems. J. Control. Release 2016, 236, 1–14.
[6]Hobernik, D.; Bros, M. DNA vaccines—how far from clinical use? Int. J. Mol. Sci. 2018, 19, 3605.
