重组蛋白药物的生产技术
健康
2024-10-21 15:32
湖北
生物药物中的核心产品是重组蛋白药物，主要通过基因工程菌来生产功能蛋白或其突变体，以弥补体内蛋白的缺失，从而在疾病治疗中发挥关键作用。近年来，重组蛋白药物在治疗疾病方面的作用日益显著，相关技术也得到了迅速的发展。重组蛋白药物的种类繁多，包括多肽药物、基因工程药物、重组蛋白疫苗、抗体类药物等。与传统药物相比，重组药物具有更高的活性和特异性，毒性更低，更为安全有效。目前市场上，重组蛋白药物的代表性产品包括胰岛素、激素、人造血因子、尼妥珠单抗等，广泛应用于临床。重组蛋白药物的整体产业链分为上游、中游和下游。其中，上游涉及基于基因工程技术和细胞工程技术的研发环节，中游包括药物及给药系统的生产制造，涵盖大规模细胞培养、重组蛋白纯化与质控等环节。目前在工业应用中，涉及到多种重组表达系统，其中在生产重组蛋白药物方面，主要采用大肠杆菌、酵母和哺乳动物CHO细胞系这三种表达系统。在这三种表达系统中，大肠杆菌系统是最为简单的一种。这个系统包括多种类型的菌株，其主要差异在于筛选标记、诱导方式、是否有信号序列、是否有营养缺陷型以及特殊蛋白质折叠机制等方面。对大肠杆菌的基因工程改造更好地完善了这个表达系统，例如编码二硫键异构酶的基因已经稳定整合到大肠杆菌的基因组中，以确保蛋白质能够正确折叠，提高胞内蛋白的折叠和溶解性。在大肠杆菌周质空间中有效分泌重组蛋白可以提高大肠杆菌表达的蛋白质可溶性。大肠杆菌表达系统主要应用于多肽类药物的生产，例如重组人类胰岛素和重组甲状旁腺激素等。酵母系统主要涵盖了酿酒酵母和毕赤酵母，另外还包括一些非传统的酵母种类，例如汉森菌多形酵母、脂酵母、裂殖酵母和乳酸克鲁维酵母菌，它们也已成为合成各种不同特性蛋白药物的宿主。酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）是广泛研究的酵母表达系统之一，被用于生物制药合成。虽然酵母能够进行N-糖基化和O-糖基化等糖基化过程，但与人源细胞的糖基化模式存在显著差异。其分泌的重组蛋白通常形成α-1,3-甘露糖化，导致蛋白的免疫原性增加和半衰期缩短。通过在酵母中精确引入人源糖基转移酶和糖苷酶，以及删除超甘露糖化基因，可以使酵母糖基化途径与人的糖基化途径相似，从而确保治疗蛋白的药代动力学特性。毕赤酵母（Pichia pastoris）生长迅速，发酵细胞浓度高，能够大量产生重组人源蛋白。毕赤酵母系统能够灵活选择合适的载体和兼容宿主，以高效经济的方式表达重组蛋白，从而确保产品的成功开发。 CHO细胞系是一种源自中国仓鼠卵巢的上皮细胞系，具备产生人同源性蛋白的能力。1986年，人体组织纤溶酶原激活剂成为第一个成功在CHO细胞系中生产并获批临床使用的重组治疗蛋白。随后，越来越多的治疗性蛋白质在哺乳动物细胞中被制造出来，并随着工艺的不断优化，该表达系统中生产重组蛋白的技术得到了迅速发展。在广泛筛选表达系统时，蛋白的高表达量、翻译后修饰质量和遗传稳定性是主要的标准。不同的表达系统具有各自的优缺点，需要根据产品的特性选择合适的系统和宿主。宿主的筛选是生产异源蛋白的关键步骤。在选择宿主时，通常采用高通量筛选技术，这种技术彻底改变了宿主筛选领域，通过使用96深孔板或类似技术对多个批次实验进行平行筛选，提高了宿主的筛选效率。最终选择的宿主必须在产品质量、滴度、特定生产率、工艺可行性、预期的电荷变体和糖基化配置、没有或较少的聚集形成以及克隆稳定性等方面满足标准。在选择最佳宿主之后，细胞培养的开发是下一个关键环节。为了更好地控制和优化细胞培养过程，已经开发出各种新的技术和工具。通常，在宿主发酵生产蛋白药物时，通过优化培养基、温度、pH、接种量和生产动力学等参数，以提高蛋白质的合成。生物量增长率是促进产品合成的关键因素，对于补料分批生产技术至关重要。一些制药公司将宿主细胞的增长率保持在小于最大增长率的特定值，通过补料来控制宿主细胞以特定增长率生长。然而，近年来，制药行业越来越关注通过将分批生产转变为连续生产，以提高生物合成效率。在发酵工具方面，使用自动化控制的一次性生物反应器系统是当今生物制药公司的新趋势。与传统的不锈钢系统相比，一次性系统具有更低的投资成本和操作成本，生产周期更短，灵活性更强，大大减少了污染的风险。这些一次性生物反应器及其附件的规模可以从50L扩大到2000L。从细胞工程到细胞培养方法的创新开发，使得单克隆抗体的产量从50 mg·L-1提高到5~20 g·L-1。通过优化良好的细胞上游培养工艺，特定的表达系统能够产生大量的重组药物蛋白，然而，其中可能包含宿主本身的蛋白、核酸等杂质，这些杂质可能对人体产生不利的生物活性。因此，对药品的纯度要求非常严格，需要对产品蛋白进行精确的纯化。这一环节是重组药物蛋白制备技术的关键，也是决定蛋白药物品质的核心。通常，单克隆抗体或其他蛋白（包括重组酶）会通过各种过滤步骤和色谱层析等技术进行纯化。色谱法是纯化有价值产品最适用的技术之一，许多成熟的色谱方法已经应用到实际的生物制药生产中。细胞培养完成后，离心、大孔径切向流过滤和深度过滤是用于初级细胞澄清的常见技术，深度过滤和生物减重过滤器有助于进行二次澄清过程。由于不同表达系统可能具有不同的分泌路径，因此可能需要采用不同的收集方式。例如，在大肠杆菌中表达的重组蛋白通常以包涵体的形式积累，需要回收后在体外重新折叠这些蛋白质，以使其具有生物活性。由于蛋白药物混合物中包含大量不同化学性质的杂质，单一的色谱技术通常难以实现良好的分离效果。传统的重组蛋白药物纯化工艺在澄清后进行超滤浓缩，然后通过逐级的单柱色谱分离纯化。为了减少纯化步骤，通常将分离纯化限制在不超过4步。随着技术的发展，一种创新的固定相结合了反相或HILIC（亲水性交换色谱）和离子交换机制，形成了一种混合模式的纯化方式。考虑到蛋白药物混合物通常需要结合多种不同分离原理的色谱技术以提高分辨率，多维色谱分离技术因此产生。在线多维色谱中，第一根色谱柱流出的产物会立即注入第二根色谱柱，从而加速分析时间。通常，在分离过程中，与多维色谱联用的质谱可以提高纯度。近年来，为了应对处理复杂生物分子混合物的纯化需求，开发了一种称为多柱逆流溶剂梯度纯化（MCSGP）技术。MCSGP技术的原理是流动相相对于固定相逆流运动，通过一系列切换阀进行模拟，实现整个过程的循环和自动化。使用MCSGP技术，目标蛋白和杂质之间的重叠峰可以在内部循环中再加工，并通过溶剂梯度进行洗脱。这种技术已成功应用于多个需要强化纯化的案例，例如单克隆抗体、寡核苷酸、大麻二酚和多肽的纯化。
