摘要：环状RNA是一类不寻常的单链RNA，其两端通过反剪接共价连接。由于它们的多功能性，体内外表达环状RNA的需求不断增加。人们已经努力高效、精确地合成环状RNA。然而，目前缺乏对环状RNA设计、合成和传递过程优化的综述。我们的综述强调了在生产最优环状RNA时考虑的多方面因素，并总结了外源性环状RNA设计和合成的每个步骤的可用选项，包括环化策略。此外，这篇综述还描述了环状RNA的几个潜在应用。
1.引言
环状RNA（circRNAs）是一类5'端与3'端通过共价键连接的RNA分子，这种结构是通过反剪接实现的。反剪接是一个将下游的3'剪接供体与上游的5'剪接受体连接的过程，该受体位于供体之前。由于其独特的结构，circRNAs在正常和肿瘤细胞中被发现具有低表达水平，三十年前首次被识别，最初被认为是错误剪接的副产品。然而，后来的研究表明，circRNAs不仅在哺乳动物中广泛表达，而且在其他多种生物中也有表达，包括其他脊椎动物、蠕虫、果蝇、植物、真菌和原生生物，以及较低的真核生物。高通量转录组测序揭示，在哺乳动物细胞和组织中表达的基因至少有10%可以产生circRNAs，进一步确立了circRNAs的广泛存在。circRNAs的生物学和临床重要性及其潜力在许多领域越来越受到重视。许多研究报告了在正常和异常条件下表达的数千种circRNAs10。circRNAs与应激相关和免疫相关反应有关，并已涉及许多人类疾病，包括癌症和神经退行性疾病。
circRNAs作为表达功能分子的有效平台。特别是在2019冠状病毒病大流行期间，通过内部核糖体进入位点（IRES）介导翻译的circRNAs被突出显示为潜在的mRNA疫苗候选物。尽管需要仔细验证circRNA编码的肽段，但可以设计和合成表现出强大且稳定蛋白质合成能力的circRNAs。Wesselhoeft等人报告说，circRNAs在人类细胞中产生的蛋白质比未修饰和修饰的核苷线性RNA分别多9倍和1.5倍，半衰期比线性RNA长1.7到2.4倍。同一组后来证明了合成circRNAs的纳米颗粒传递和体内翻译是可行的。最近的一项研究表明，circRNA疫苗可以保护小鼠和猕猴免受SARS-CoV-2的不同变体的侵害，与线性RNA疫苗相比，具有改善的效力和类似的免疫原性。这些有希望的应用已被业界注意到，默克公司是重要的投资者之一。默克公司同意在Orna Therapeutics, Inc.上花费高达37.5亿美元，这是一家旨在从合成circRNAs开发药物的新创公司。Laronde，另一个有类似目标的团队，到2021年已经筹集了4.4亿美元。
考虑到这些趋势，确定外源性circRNA合成和传递的最佳方法，以及在所需组织中特定表达的方法是至关重要的。在这篇综述中，我们描述了如何优化外源性circRNAs表达的每个步骤，以及可能选择的优势和局限性。此外，我们讨论了circRNAs作为治疗应用中效应分子的潜力。
2. 外源性环状RNA合成
要表达外源性环状RNA，首先需要决定是通过体外转录（IVT）、环化和RNA传递来生成环状RNA，还是通过注射DNA构建物并通过体内转录来生成环状RNA。有多种RNA环化和体内转录或IVT的协议，导致对外源性环状RNA表达的不同选择（表1）。在这里，我们描述了体内外合成环状RNA的验证试验。
表1. 环状RNA合成策略。
2.1.通过体内转录生成环状RNA
早期研究使用高度表达的环状RNA的天然内含子来确保环状RNA的强大转录和环化（图1a）。然而，这些构建物产生了RNA形式的混合物，即环状RNA和线性RNA，表明构建物必须被优化以强有力地转录预期的线性RNA，并通过体内反剪接诱导它们的环化。
随着越来越多的参与反剪接的顺式和反式作用因子被鉴定，研究者们进行了使用这些因子进行环状RNA异位表达的研究（表2）。研究人员通过插入内含子互补序列（ICSs），将剪接位点聚集在一起（图1b）。Qi等人描述了环状RNA调节因子的工程，它结合了环状RNA载体和同源二聚体RNA结合蛋白（RBPs）的RNA结合基序以及核定位信号（图1b）。从PUM1引入RNA结合域与ZBTB18、HNRNPA1和PRKAR1A相结合，结果表达水平与ICSs相似，不影响线性RNA表达。
Meganck等人试图通过部分删除带有反向ALU元件的ZKSCAN1和HIPK3内含子来增加天然内含子的环化效率。在最近的研究中，使用了circPVT1骨架，因为较短的外显子序列与广泛使用的ZKSCAN1内含子没有高效环化。在2021年，同一组在模型的上游和下游内含子中生成了一系列插入和删除，以研究ALU元件与剪接接头之间距离的影响。这些实验揭示了通过截断上游和下游内含子使ALU元件更接近剪接接头可以增强环状RNA和蛋白质表达高达五倍。作者指出，与使用“Twister”核糖酶的Tornado系统相比，具有合成内含子的系统具有多个优点，因为合成内含子可以进一步改进，它们的短长度使研究人员能够将系统包装成重组腺相关病毒（AAV）载体，允许在广泛组织中长期基因表达。控制细胞中表达的环状RNA量可能很困难，因为转录和环化可能受到内源性因素的影响。
2.2.体外RNA环化
另一种诱导RNA环化的常见方法涉及使用排列的内含子-外显子系统（PIE），它包括由I组自剪接内含子包围的外显子序列。这种方法能够在体外和体内表达所需的环状RNA。Anabaena前tRNA内含子和T4噬菌体td基因内含子被广泛使用，有一些修改（图1c）。Litke等人设计了Tornado系统，它利用普遍表达的、tRNA前体连接的、RtcB兼容的5'和3'端和“Twister”核糖酶（图1c）。进一步的研究表明，Tornado系统能够在体内强有力地表达稳定的环状RNA，并且这些环状RNA发挥指定的生物学作用。然而，Tornado系统的一个缺点是，基于核糖酶的环化在结果环状RNA中留下了一个不想要的外显子序列，称为“疤痕”。基于I组内含子生成环状RNA不可避免地会在产品中留下80-180 nt长的序列，这些序列来自两个相邻的外显子（通常称为E1和E2）。这些疤痕将不想要的序列引入最终产品，并且这些序列可能引发免疫反应或对实验结果产生意外影响。
2.3.生成无疤痕环状RNA的策略
为了克服疤痕问题，Rausch等人筛选了T4 td内含子自剪接所需的可能的外显子-内含子对，并建议排列所需的外显子序列，以确保5'和3'末端类似于T4 td基因的E2和E1外显子序列（图1d）。作者展示了他们的构建物可以轻松地在体外产生没有T4外显子序列的环状RNA。与Tornado系统的转染不同，修改后的无疤痕系统的转染没有引发免疫反应。寻找合成无疤痕环状RNA的方法的努力正在进行中，并且是一个活跃的研究领域。Zuo等人设计了一种新策略，称为Clean-PIE，可以利用排列的T4 td内含子在体内外应用。作者在他们的构建物的ORF中隐藏了剪接反应所需的E1和E2序列，并优化了E1和E2序列的可变部分。在Wang等人的另一项研究中，使用II组内含子在体外产生无疤痕环状RNA。在这项研究中，II组内含子的D1域中的外显子结合位点被修改；因此，它可以结合到圆形外显子进行自剪接。这个骨架不是普遍适用的，因为圆形外显子的序列在基因之间不同；因此，D1序列应该为不同的基因进行不同的修改。
另一组采用了四膜虫的I组内含子，这是一种反剪接核糖酶，能够高效地实现无疤痕的RNA环化。Lee等人将目标序列（5'-NNNNNU-3'）连接在感兴趣基因的3'端，并与内含子本身相连，允许端到端的自我靶向和剪接发生。结果表明，与PIE方法相比，该系统可以诱导更强大的环状RNA表达，尽管作者指出自我环化仅在体外有效。他们研究了该系统是否可以通过分子间剪接生成多聚体环状RNA，并得出结论这是不可能的。作者建议只存在一个目标位点以实现精确剪接。同样，Cui等人设计了一个带有骨架和侧翼反义序列的构建物，以帮助四膜虫热嗜菌内含子的自我剪接。效率在体外和体内都约为80%。他们使用这种方法合成了circFOXO3，并发现该产品可以用于调节前列腺癌细胞中的各种细胞表型，如增殖、迁移和凋亡。
2.4.使用化学或酶生成环状RNA
环状RNA也可以通过化学或酶催化的反应从线性前体体外生成。一般来说，使用化学方法合成RNA会产生短的寡核苷酸（约50-70 nt）。因此，需要额外的步骤将几个RNA连接起来以合成更大的分子。化学环化RNA的另一个挑战是，线性前体的浓度应该很低，以防止其寡聚化，这会导致通量低。这种方法需要预先定位两个反应端，这可以使用线性或发夹辅助寡核苷酸或夹板来完成。有几种酶可以用于分子内连接；最常用的是T4 DNA连接酶和T4 RNA连接酶1和2。特别是，T4 RNA连接酶可以产生大量均匀和纯净的环状RNA49。
尽管化学反应环化有许多缺点，每种方法都有其优点和限制，应根据环状RNA产品的几个特征（即体内或体外生产、天然或修饰核苷酸和构建物大小）来选择方法。感兴趣的序列长度可能限制了合成方法的选择，因为使用化学方法和PIE系统合成大分子存在困难。实际上，如果剪接位点之间有长的（1.1 kb）间隔区域，PIE系统就不起作用。此外，长RNAs往往环化效率较低，在IVT期间和之后存在镁离子时更容易被切割。化学或酶基方法仅在体外产生环状RNA，而基于核糖酶的方法可以在体外和体内强有力地生成环状RNA。因此，基于核糖酶的方法经常用于表达内源性RNA序列。
3.信使环状RNA载体的设计
合成编码多肽的“信使环状RNA”需要设计考虑顺式作用因素的环状RNA载体，以强有力地表达所需的蛋白质（图2）。IRES、5'和3'非翻译区（UTRs）以及编码区的选择可以影响翻译效率。
载体拓扑结构对IRES介导的翻译至关重要，因为IRES是一个招募核糖体的结构元素。重要的是要确保IRES两侧的序列不会通过形成复杂的二级结构干扰IRES活性。在这种情况下，添加间隔子以分离每个二级结构可以促进翻译。一项研究报告称，添加间隔子以减轻IRES引起的结构障碍可以改善翻译。最近的一项研究得出结论，将nt长的间隔子放置在T4 td内含子的剪接疤痕和IRES之间，可以产生最强大的翻译。此外，Liu等人表明，环状RNA中的RNA双链可能激活PKR的降解。因此，设计整体序列以最小化RNA双链的形成是很重要的。
脑心肌炎病毒的IRES是最常用的IRES，因为它的表达强大且不具特异性，不需要许多IRES反式作用因子。然而，对各种IRES的广泛比较显示，柯萨奇病毒B3（CVB3）的IRES在几个细胞系（HEK293、HeLa、A549和Min6）中效率最高。进一步的调查表明，Echovirus的IRES比CVB3的IRES具有更强的翻译信号。后来的一项研究调查了一系列病毒IRES以优化环状RNA翻译；作者得出结论，人类鼻病毒B和肠病毒B物种的IRES可以驱动强大的翻译，并进一步阐明病毒IRES的翻译效率可以通过插入真核翻译启动因子（eIF）G4相关的适配体来进一步提高。此外，这项研究生成了随机序列以筛选IRES活性，并且鉴定了几个具有强大翻译驱动能力的序列。
UTR序列已知可以调节RNA翻译、转录后调节和RNA稳定性的多个方面。UTRs包含许多对翻译有积极或消极影响的序列和结构元素。其中一个被充分描述的例子是5' UTR中多聚（A）结合蛋白（PABPs）的结合位点，这有助于eIFs的结合；此外，已知高度结构化的5'-UTR会减弱翻译效率。在构建物中包含多聚（A）或多聚（AC）序列可以提高翻译强度并减少免疫原性。Chen等人指出，添加PABP基序和招募eIF4G的适配体序列可以增加圆形报告的翻译。少数线性mRNA的3'UTRs，如人类β-珠蛋白，已被证明可以增强蛋白质生产。大多数倾向于推动线性RNA有效翻译的3'UTRs，除了人类α-珠蛋白2的3'UTR外，似乎对环状RNA没有这样做。密码子三联体在翻译过程中被tRNA识别，长期以来一直有争议的是密码子使用和tRNA的丰度是否会影响翻译效率和速度。翻译的动力学对于正确的蛋白质折叠和翻译延伸至关重要；因此，优化同一氨基酸的密码子可能促进有效的蛋白质生产。这个研究领域还没有得到严格的探索；然而，研究表明，消除IRES和编码序列相邻末端之间的不利碱基配对相互作用可以进一步促进环状RNA翻译。
4.合成环状RNA或DNA构建物的传递
在体外转录（IVT）介导的环状RNA合成过程中，产生的分子必须经过严格的纯化。需要通过凝胶提取或尺寸排除高效液相色谱进行纯化，因为Anabaena内含子或稀有的环状串联对RNase R的降解具有抵抗力。也可以使用固相DNA探针方法来从总RNA中纯化环状RNA，该方法设计了一个DNA探针与所需产物的反剪接接头杂交。
构建物的大小和所需的靶向特异性可以影响传递载体的选择。环状RNA可以有效地通过脂质、金纳米粒子、AAV载体、慢病毒载体、外泌体和转座子进行传递。纳米药物传递的最新进展表明，纳米粒子可能增加目标特异性。尽管每种方法都有其独特的局限性和优势，但金纳米粒子的毒性仍在讨论中。外泌体可能比纳米粒子更具有生物相容性，但需要复杂的制造工艺。对于裸环状RNA的传递，溶剂的优化可能导致更大的细胞摄取，如Yang等人的一项研究所显示，使用Ringer溶液在肿瘤部位实现了报道的最高摄取量。
5. 环状RNA表达的细胞内调节
内源性环状RNA表现出严格调控的表达，具有长半衰期的稳定性，并且对RNA降解机制有抵抗力。环状RNA的水平受多个步骤中许多因素的影响；因此，需要考虑几个因素以实现稳定表达（图3）。
5.1. 反剪接的调节
反剪接效率是多个层面上的许多因素的组合，包括染色质状态和外显子及其侧翼内含子中的序列环境（图3a）。在表观基因组水平上，包括H3K4me1、H3K36me3、H3K79me2和H4K20me1在内的几种组蛋白修饰影响环状RNA生物生成。然而，一些外显子比其他外显子更倾向于被环状RNA处理，一个外显子上发生的反剪接越多，在正向剪接期间就越容易发生外显子跳跃。然而，外显子跳跃并不能保证该外显子被包含在环状RNA中；因此，需要额外的调节水平来实现外显子环化。在裂殖酵母中有几例报告称环状RNA生物生成独立于顺式或反式元素，尽管已有多种顺式或反式作用因子被报道促进或阻碍环状RNA产生。内含子互补序列（ICSs）是最重的顺式作用元素之一，尽管它们的重要性在物种间有所不同。ICSs可以是倒置重复或非重复元素。在人类成纤维细胞中，绝大多数（88%）的ICSs包含ALU重复。
除了顺式作用因子外，RNA结合蛋白（RBPs）可以促进或破坏外显子环化（表2）。Quaking结合在侧翼内含子上并形成同二聚体，将剪接位点聚集在一起。相反，A-to-I编辑蛋白（ADAR1）可以通过A-to-I编辑破坏反剪接所需的RNA对。然而，RBPs在环状RNA生物生成中的作用需要进一步研究，因为RBPs的效果可能因环状RNA类型和细胞系而异。例如，HNRNPL增加了HeLa细胞中circmCherry报告基因的表达；然而，对HNRNPL敲除的LNCaP细胞的研究表明，内源性环状RNA被下调而不是上调（表2）。同样，Slu7的敲除导致DL1细胞中环状RNA的富集和HeLa细胞中circmCherry的耗尽。
表2. 已知影响外显子环化的RNA结合蛋白。
反剪接由剪接体机械执行，并在大多数情况下涉及规范剪接位点（99%），因此它与正向剪接竞争，尽管正向剪接的效率超过100倍。因此，抑制正向剪接可能对促进反剪接很重要。去除剪接体复合体的一些核心因素和用剪接抑制剂处理允许更多的反剪接事件发生。尽管预期正向和反剪接之间存在竞争，但早期的全基因组研究表明，圆形和线性异构体的水平并不完全相关，尽管研究人员已经做出了进一步的努力，以圆周比率（CLR）来定义反剪接的效率。CLR是支持反剪接的测序读数与支持正向剪接的读数的比率。尽管已知大多数人类位点的CLR小于1%，但有些环状RNA被强有力地表达，有时积累的水平超过其相应的线性形式。然而，调节反剪接效率的确切机制仍有待阐明。
5.2. 环状RNA表达的上下文特异性
环状RNA已知表现出对某些生物学条件非常特定的表达模式，并且独立于线性同种型，增加了理解环状RNA表达控制的难度。最近一项使用90个人体组织转录组的研究显示，36-75%的替代反剪接事件是组织特异性的。对组织环状RNA概况的调查揭示，不同的大脑区域，如嗅球、前额叶皮层、海马和小脑，具有最多的组织特异性环状RNA。相比之下，心脏、肝脏和肌肉具有最少的组织特异性环状RNA。这些特征不仅限于内源性环状RNA。合成环状RNA的工程进展揭示了外源性环状RNA对组织和细胞类型的相似特异性。将携带编码绿色荧光蛋白环状形式的序列的AAV载体注入小鼠，导致不同组织中的转导率不同，尽管AAV载体已知可以广泛表达编码序列，没有任何组织偏好。
环状RNA特异性超出了组织或细胞类型水平，包括细胞间变异和不同的亚细胞定位模式（图3c）。单细胞研究加强了从细胞到细胞环状RNA概况变化的观点。关于环状RNA的亚细胞定位知之甚少；然而，外显子环状RNA主要定位在细胞质中，而那些带有内含子序列的主要留在核中。一些环状RNA的核输出似乎是由它们与UAP56或URH49的长度依赖性关联介导的，它们是RNA螺旋酶，可以招募REF适配蛋白到RNAs。另一项研究表明，YTHDC1，一个m6A阅读蛋白，通过m6A修饰介导circNSUN2的核输出；这是m6A与环状RNA易位相关的第一个报告。在最近的一项研究中，系统地检查了HepG2细胞的核、细胞质、线粒体、核糖体、细胞质和外泌体分数中环状RNA的代表性。结果表明，不同区室中的环状RNA在长度和G/C含量方面具有不同的特征。在神经元中，一些环状RNA已被证明定位在突触；然而，决定这种定位的元素尚不清楚。几项研究已经检查了功能性线粒体环状RNA，并揭示了它们在应激条件下的细胞内表达水平发生了变化。总体而言，这些结果表明环状RNA表达在不同的亚细胞位置受到严格调节。来自持续努力调查环状RNA亚细胞定位的数据已经被整合到可视化定位信息的平台中。
5.3. 环状RNA水平的细胞内调节
一个显著的特征区分了环状RNA，即它们显著的稳定性。研究人员发现，环状RNA的半衰期平均是线性mRNA的两到四倍，有时甚至长达十倍。这种差异主要源于缺乏可以被外切核酸酶攻击的5'和3'末端核苷酸，这阻止了环状RNA在正常或压力条件下的降解。在病毒感染期间，RNase L通过一种未知机制被激活，并作为先天免疫反应的一部分，全球性地降解与PKR相关的环状RNA（图3d）。Park等人鉴定了RNase P和MRP作为与YTHDF2和Hrsp12相互作用的环状RNA降解剂，这两种蛋白质识别带有m6A修饰和GGUUC基序的环状RNA。果蝇GW182，P体的一个关键组成部分，以及其人类同源物TNRC6A/TNRC6B/TNRC6C通过AGO2非依赖机制参与环状RNA衰减，它们的耗竭显著增加了细胞质环状RNA的稳态水平。
考虑到这些机制按顺序发挥作用，环状RNA异构体可能通过不同机制进行衰减，可能导致与压力反应相关的环状RNA的富集。在正常情况下，大约三分之一的人类环状RNA预计具有高度结构化，它们通过UPF1和G3BP1介导的结构介导的RNA衰减（SRD）进行全局调节。G3BP1选择性地结合高度结构化的环状RNA，是SRD的决定因素。SRD靶标似乎优先排除在压力诱导处理后UPF1和G3BP1定位的压力颗粒之外。综合这些结果表明，环状RNA的降解机制在正常和压力条件下不同。上述提到的因素都不是专门针对环状RNA的；因此，可能有其他未知的途径负责调节环状RNA的稳态水平。
使用人类细胞系的研究表明，环状RNA可以被积极地输出（图3e）。几份报告表明环状RNA在外泌体、循环和尿液以及各种细胞系分泌的外泌体中富集。此外，发现带有5'-GMWGVWGRAG-3'基序的环状RNA被选择性地包装成外泌体。然而，环状RNA分泌的确切机制及其对供体和受体细胞的影响仍然未知。
6.外源性环状RNA的免疫原性
工程化环状RNA的免疫原性仍然是有争议的。Chen等人表明，使用包含T4 td基因内含子的PIE系统转染环状RNA触发了几种免疫基因的表达，而使用ZKSCAN1内含子生成的环状RNA转染则没有。随后，他们观察到m6A修饰可以作为“自身”环状RNA的分子标记。另一项使用Anabaena内含子的研究报告称，生成的环状RNA没有引起免疫反应。这后来被最近的研究挑战，得出结论，由I组内含子产生的环状RNA是免疫原性的，可能由于最终产品中残留的内含子“疤痕”。这种不一致可能是由于测试免疫原性的方法不同或用于比较的线性RNA类型不同，因为上述所有研究都使用了不同的方法来评估环状RNA的免疫原性。
然而，尚未详细讨论携带环状RNA的载体的免疫原性。迄今为止，通过AAV载体或慢病毒载体转导的环状RNA显示出微不足道的免疫激活能力。
7.工程化环状RNA的应用
最近，几项研究使用环状RNA技术来研究或控制细胞过程和免疫反应（图4）。环状mRNA疫苗对SARS-CoV-2感染显示了有效的保护（图4a）。此外，环状RNA有助于减少基因治疗应用中有效载体剂量，因为它们的蛋白质产物的表达水平可能随着时间的推移而增加。
环状RNA也已在DNA编辑和RNA调节中使用。两个小组使用ADAR和圆形引导RNA进行体内外RNA编辑（图4b, c）。几种siRNA模拟物、RNA哑铃和适配体已被证明在循环形式中表现强大，稳定性得到改善（图4d–f）。
8.结论
环状RNA已经显示出作为下一代疫苗和治疗分子的潜力。在这里，我们展示了在开发环状RNA平台时可以选择的几个选项和可以考虑的几个方面。保证环状RNA或所需蛋白质最大细胞水平的合理序列设计至关重要。人们也可以采用适当的传递方法，并通过优化溶液来增强细胞摄取。环状RNA在不同的组织和细胞类型中可以不同地表达，应该努力最小化环状RNA的免疫原性。
我们的目标是展示如何修改外源性环状RNA合成的过程，使其更有效率，更适合环状RNA合成。通过考虑环状RNA应用的每一步，我们相信人们可以以最大的潜力实现所需的结果。最终，这些步骤将成为工业合成环状RNA的标准程序。
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