AAV病毒载体的制造挑战和合理配方开发
健康
2024-10-20 00:04
湖北
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摘要:腺相关病毒（AAV）因其卓越的安全性和对各种靶组织的高效转导能力，已成为治疗多种疾病的基因传递领域的领先平台。然而，病毒载体的大规模生产和长期储存效率不高，导致产量较低、纯度适中，并且与重组蛋白治疗剂相比，货架寿命更短。这篇综述提供了对AAV载体制造过程中遇到的上游、下游和配方单元操作挑战的全面分析，并讨论了如何通过理解降解机制和配方策略，在整个产品货架寿命期间保持期望的产品质量属性。文中强调了病毒载体在生产和货架寿命期间可能遇到的各种物理和化学不稳定性的机制，这些不稳定性可能因为各种压力条件（如热、剪切、冻融和光照）而产生。还讨论了缓冲液、pH值、辅料和杂质对病毒载体稳定性的作用。因此，这篇综述的目的是概述提高基于AAV的药品质量的工具和潜在路线图，强调了对所涉及过程的机理理解的必要性。![]()
几十年来，技术取得了显著进步，为治疗和控制威胁生命的疾病提供了选择。这个新时代最具革命性的进展之一是基因治疗。在其最基本的定义中，基因治疗（也称为人类基因转移）是将感兴趣的基因传递到患者的细胞中，作为治疗威胁生命的疾病的治疗方法。基因治疗的临床成功在很大程度上取决于将遗传物质有效地传递到目标细胞。已经评估了几种不同的基于病毒的载体和非病毒系统用于基因传递，包括纳米粒子、脂质体、慢病毒、腺病毒和腺相关病毒（AAV）。与其他基因治疗传递系统相比，AAV因其多种理想属性而成为主要的载体，包括缺乏致病性、对分裂和非分裂细胞的高效感染以及病毒基因组的持续维持。目前市场上有两个基于AAV传递技术的FDA批准的基因治疗产品。2017年，FDA批准了Luxturna作为治疗一种罕见遗传性失明的AAV2基因疗法。同样，在2019年，批准了一种基于AAV9的治疗，Zolgensma，用于治疗脊髓性肌肉萎缩症（SMA）。此外，还有数百种基于AAV的基因治疗产品正在不同的临床试验阶段进行测试。表1提供了一些例子。这些AAV治疗的突破性里程碑鼓励制药公司增加对基因治疗产品开发和生产能力扩张的投资，以满足临床/商业需求和供应。然而，尽管在临床和商业上取得了显著成功，病毒载体的成本效益生产仍然是一个挑战，主要是因为缺乏对各种工艺如何影响AAV产品质量和货架寿命的清晰机制理解。这是因为AAV基因治疗的临床开发已经超越了CMC、制造和配方开发。这篇综述讨论了AAV生产和储存过程中遇到的各种制造步骤和挑战，并提供了改进制造工作流程效率和提高产品货架寿命的路线图。表1：使用AAV病毒载体的正在进行的临床试验示例。2.1. 病毒及其结构AAV病毒载体由一个蛋白质外壳组成，保护着一个大约4.7千碱基（kb）的小型单链DNA基因组。AAV病毒载体属于细小病毒科。AAV基因组的有效复制和病毒基因表达需要与第二种辅助病毒（如腺病毒或疱疹病毒）共感染。图1展示了AAV病毒载体的衣壳表面和结构域。AAV具有一个八股反平行β桶结构和一个α螺旋。β桶构成了衣壳的核心，β片形成内表面，为包装的单链DNA提供封闭空间。单链基因组包含三个基因，Rep（复制）、Cap（衣壳）和aap（组装）。这些编码序列由末端反向重复序列（ITRs）所包围，它们对基因组复制和包装是必需的。Rep基因编码四种蛋白（Rep78、Rep68、Rep52和Rep40），它们对病毒基因组复制和包装是必需的。Cap基因编码三种重叠的结构性病毒衣壳蛋白（VP1、VP2和VP3），它们构成外衣壳，保护病毒基因组，并积极参与细胞结合和内化。衣壳蛋白病毒外衣由60个蛋白质组成，以二十面体结构排列，衣壳蛋白的摩尔比大约为1:1:10（VP1:VP2:VP3）。在衣壳蛋白中，VP1是最大的（87 kDa），其次是VP2（72 kDa）和VP3（62 kDa）。这三种衣壳蛋白包含一个共同的β桶结构，但N端延伸部分不同。可变环为每种AAV变体创造特定的表面拓扑结构，介导分子相互作用，负责细胞结合、进入和免疫学特性。![]()
图1. AAV基因组结构的示意图。(a) 外部衣壳表面按径向颜色编码（从衣壳中心到表面：蓝色到绿色到红色到黄色；约80到140埃）。白色三角形描绘了由五重轴（5f）和两个三重轴（3f）界定的病毒非对称单元，由通过二重轴（2f）的线分隔。示例表面特征在不同血清型之间有所不同，包括VR-IV、VR-VII、DE环和HI环。(b) 横截面显示它们的内部表面。深蓝色区域显示β-链和β-片层二级结构元素。(c) AAV具有大约4.7千碱基（kb）的线性单链DNA（ssDNA）基因组，在末端有两个145核苷酸长的反向末端重复序列（ITR），三个箭头分别指示位于5、19和40位置的三个启动子。调控蛋白（Rep78、Rep68、Rep52和Rep40）由rep基因编码。Rep52和Rep40从p19启动子表达，而Rep78和Rep68从p5启动子转录。Rep68是Rep78的剪接变体，剪接位点对Rep52和Rep40转录本是共同的。结构蛋白由cap基因编码。有三个衣壳蛋白VP1（病毒蛋白1）、VP2、VP3，由p40启动子转录调控，分子量分别为87、72和62千道尔顿。这些衣壳蛋白组装成一个由60个亚基组成的近乎球形的蛋白质壳。p40表达产生两种mRNA，第一种编码VP1，第二种是剪接变体，编码VP2和VP3。核糖体的读码产生VP2和VP3的化学计量量。所有AAV转录本共享相同的聚腺苷酸信号（polyA）。AAP促进主要衣壳蛋白VP3的核输入，并促进衣壳的组装和成熟，但AAP不存在于成熟的衣壳中。aap基因在一个与cap基因重叠的替代阅读框中编码组装激活蛋白（AAP）。这种核蛋白为衣壳组装提供了支架功能。aap基因编码组装激活蛋白（AAP），它与cap基因重叠，在另一个阅读框架中。这种核蛋白为衣壳组装提供支架功能。已有100多种自然发生的AAV在人类和动物中被分离出来，每种在它们的衣壳组分上都有所不同，并表现出不同的细胞趋向性、转导效率和免疫原性。一种AAV血清型的Rep蛋白可以补充来自另一种AAV血清型的ITRs。AAV5是个例外，它与已知的任何AAV血清型同源性最低，其ITR包含一个独特的末端分辨率位点（TRS）。SDS-PAGE和负染色电子显微镜（EM）显示了各种AAV血清型，如图2A所示。AAV在稳定性上也彼此不同（图2B），这是通过差示扫描荧光热熔研究确定的。这种Tm差异可能与血清型之间的结构差异有关。该研究还证明，所有测试的AAV的完整衣壳和空衣壳具有相似的Tm值。在另一项类似的研究中，比较了各种AAV血清型的物理特性，特别是AAV1、AAV2、AAV5和AAV8，以确定影响它们热力学稳定性的因素。使用差示扫描荧光热分析法（DSF）进行的热稳定性测量显示，最不稳定和最稳定的血清型之间的衣壳熔化温度相差超过20°C，分别是AAV2和AAV5。不同病毒蛋白的相对大小及其四元包装是决定个别AAV稳定性的主要因素。图2. 全rAAV1-rAAV9-gfp和rAAVrh.10-gfp（包装绿色荧光蛋白转基因）载体在PBS中的样品评估和稳定性。(a) Coomassie染色的SDS-PAGE（左）和负染色EM（右）分别显示了rAAV1-rAAV9和rAAVrh.10，每个面板上方都标有相应的指示。AAVrh.10 EM图像中显示了一个100纳米的尺度条。(b) 通过差示扫描荧光分析（DSF）获得的rAAV1-rAAV9和rAAVrh.10的热特性（以标准化的相对荧光单位，RFU表示）与温度（T（°C））的关系。每个特性根据右侧所示的血清型进行颜色编码。图来自Bennett等人的研究。选择特定的AAV作为基因转移载体取决于以下标准：(1) 目标细胞/组织类型；(2) 与传递基因相关的安全概况；(3) 选择系统性与局部递送；以及(4) 使用组织特异性或组成性活性启动子。AAV变体中编码的糖结合倾向的差异介导了分子相互作用，这些相互作用负责细胞结合、进入和免疫学特性。在最初与细胞表面糖链（例如，肝素硫酸、N-连接的唾液酸、半乳糖等）结合后，AAV进入目标细胞是通过与如成纤维细胞生长因子受体、表皮生长因子受体和血小板衍生生长因子受体等辅助受体的相互作用介导的。例如，由于其衣壳序列中独特的氨基酸差异，AAV9偏好通过半乳糖作为原发细胞的结合。据推测，这种优先结合半乳糖的能力可能赋予AAV9独特的穿越血脑屏障（BBB）并感染包括原发神经元在内的中枢神经系统细胞的能力。除了主要的碳水化合物相互作用外，还鉴定了次级受体，这些受体也在病毒转导中起作用，并对病毒变体的细胞和组织选择性做出贡献。AAV2使用成纤维细胞/肝细胞生长因子受体和整合素αVβ5和α5β1；AAV6利用表皮生长因子受体，而AAV5利用血小板衍生生长因子受体。AAV8已被证明能够有效地转导并递送啮齿动物和非人灵长类肝脏的基因，目前正在临床试验中探索用于递送血红蛋白病和其他疾病的基因。同样，AAV1和AAV9已被证明在各种动物模型中有效地递送心脏和骨骼肌的基因。工程化的AAV1目前正在临床试验中作为心力衰竭的基因转移因子，并且已被批准用于治疗脂蛋白脂肪酶缺乏症。尽管已经鉴定了不同的AAV载体，它们优先转导许多不同的细胞类型，但仍存在某些细胞类型，AAVs已被证明难以转导。Zolgensma是AAV9，可以说是迄今为止最成功的基因疗法。然而，根据其在冷冻条件下仅有12个月的货架寿命和在2-8°C下仅有14天的稳定性，它的配方可能不是最稳定的。AAV2血清型已被用于血友病B的肝脏和肌肉的基因转移临床试验，并已被批准作为Luxturna用于视网膜治疗Leber先天性黑蒙。对这些AAV血清型的衣壳进行合理修改，有望在不久的将来实现有希望的临床转化。AAV病毒载体的生产是一个复杂的过程，需要创新的方法来满足安全性和有效性要求、临床和市场需求以及货物成本目标。准备稳定的病毒载体，防止它们在制造、处理和储存过程中的降解，并维持它们长期稳定性和有效性是AAV制造商面临的主要挑战。需要结合传统方法和新技术来开发可扩展且稳健的基因治疗产品制造工艺。病毒载体制造工作流程如图3所示，包括上游、下游配方和灌装/完成处理单元操作。下面讨论制造单元操作工作流程及相关挑战。图3. 病毒载体制造过程的工作流程，涉及各种上游、下游、配方和填充/完成步骤。结果已总结，并且讨论了需要克服的挑战。上游病毒载体生产中的单元操作包括：(1) 质粒开发和生产，其中设计并生产一种顺式质粒（编码由AAV反向末端重复序列（ITRs）包围的感兴趣基因（GOI））、一种反式质粒（编码AAV rep和cap基因）以及一种辅助质粒（编码腺病毒（Ad）辅助基因、E2A、E4和VA RNA）；(2) 细胞扩增，其中E1转导的细胞（例如贴壁的HEK293T或悬浮的HEK293）扩增到所需的细胞密度；(3) 质粒转染，当细胞达到所需密度后将质粒引入细胞；以及(4) 病毒载体生产，其中短暂转染的细胞随后被允许生产病毒数天。质粒DNA本质上是AAV生产的起始材料。质粒DNA通常在重组大肠杆菌发酵中生产，期间适当的遗传序列被扩增，然后收获、纯化，并进行安全性测试。发酵过程中批次间的一致性，以及所产生质粒的产量和纯度的大批次间变异性是AAV生产中的主要问题。在质粒DNA生产中，以超过95%的纯度生产GMP级质粒DNA，并使其免受与工艺相关的杂质和变体的影响，仍然是一个挑战。质粒DNA生产的低产量也是一个问题。因此，为了满足AAV治疗的日益增长的需求，需要通过使用明确定义的介质和工艺控制来改进质粒制造过程，以获得更好的产量和产品一致性。基于HEK293的短暂转染过程在实验室规模上容易执行。然而，放大过程产生了很多变异性。通过增加细胞培养的表面积来实现贴壁细胞的放大，这在实践中是通过增加平行培养板（一种扩展规模的方法）来完成的。使用贴壁细胞带来了许多挑战，包括放大、在处理培养系统过程中的污染风险，以及监测和调节培养条件（如氧气浓度、pH值等）的困难。另一方面，基于悬浮的细胞培养提供了可扩展性；然而，与贴壁细胞相比，每单位体积的细胞密度通常较低。三质粒转染系统在悬浮细胞培养中仍然有些效率低下，因为并非所有细胞都接收到有效包装所需的质粒的最佳比例。质粒不平衡也可能导致不同病毒载体批次之间空满衣壳比率的变异。使用动物源性产品，如血清，可能是产品污染物的来源；因此，绝对需要最小化细胞培养步骤中意外代理（AA）污染（病毒、微生物）。由于病毒载体在大小和特性上与意外病毒相似，因此不可能在不影响产品产量和效力的情况下将两者分离。更好的定义化学介质以及下游平台分离技术将显著降低污染风险。开发稳定细胞系，将血清型特异性衣壳和基因感兴趣序列导入细胞基因组，将是一个理想的解决方案。最常用的方法是短暂三重转染哺乳动物细胞或感染哺乳动物（如HEK293）和昆虫细胞（如杆状病毒）。转染效率和DNA及转染试剂的高成本是载体生产中的主要挑战。通常，在三个DNA质粒转染后在HEK293细胞中生产AAV载体，一个顺式（编码AAV ITRs和GOI）、一个反式（编码AAV rep和cap基因）以及一个辅助质粒（编码Ad辅助基因）。成功转染所有三个质粒是生产AAV载体所必需的，否则会导致低滴度和不完全的病毒包装。有几种质粒转染方法；然而，每种都有其自身的局限性。磷酸钙方法由于试剂纯度和pH敏感性，批次间变异性显著。脂质体转染效率极高，细胞毒性最小，但试剂成本更高，特别是在商业AAV生产所需的规模上。最广泛使用的聚乙烯亚胺（PEI）对生产细胞有毒，其性能对pH变化敏感。下游过程包括从过程和产品相关杂质中纯化病毒颗粒，包括宿主细胞材料、质粒DNA和空衣壳。近年来已开发出几种纯化AAV载体的过程，它们之间差异显著。典型的下游过程包括：(1) 通过洗涤剂、机械应力、高渗冲击或冻融程序进行细胞裂解以释放病毒；(2) 核酸去除，通过内切核酸酶消化裂解物以减少核酸污染物；(3) 通过离心或微滤固体去除，去除细胞碎片和碎屑，然后进行色谱纯化；(4) 亲和色谱，去除宿主细胞蛋白（HCPs）和任何血清蛋白杂质；(5) 通过铯氯密度梯度超速离心程序或离子交换色谱分离含有完整基因的传染性病毒与空的、非传染性病毒；以及(6) 最终纯化，使用核心珠吸附剂进一步减少HCPs或其他低分子量污染物。下游处理可能占病毒生产总成本的很大一部分；因此，需要一种有效且可重复的方法，以成本效益的方式生产高纯度和均匀的病毒载体群体。主要挑战包括细胞裂解、过滤和纯化，缺乏一种有效且可重复的平台方法来分离满衣壳和空衣壳。有几种机械和化学方法用于细胞裂解。基本的机械技术是通过反复冻融，然后进行低速离心步骤来释放AAV载体。然而，这种技术不适合大规模纯化，因为很难放大。机械匀浆，如法国压榨，是另一种裂解方法，通过高压将介质中的细胞强制通过孔口。由于高剪切力，细胞在进入孔口时受到压缩，在排放时膨胀，发生膜的破裂。尽管这种方法可以放大，但它通常会导致产品损失，因为剪切应力诱导的聚集和沉淀。使用洗涤剂进行化学裂解已经使用了Triton X-100作为主要的洗涤剂进行细胞裂解，并在病毒载体纯化过程中提供了足够的总产量。它很容易放大；然而，最近的研究表明，Triton X-100造成了一些急性口服毒性、眼睛损伤、皮肤刺激和慢性水生毒性。因此，由于对其安全性的辩论，这种洗涤剂在2016年12月被欧洲化学品管理局在REACH法规下列为高度关注物质（SVHC）。因此，需要一种替代的细胞裂解方法，不仅能裂解细胞，还能在纯化过程中保护AAV载体免受各种压力。过滤是AAV下游处理中最昂贵的单元操作。过滤过程中的剪切应力可能导致AAV颗粒聚集或失去功能。细胞裂解产生大量细胞碎片，这些碎片很难通过过滤器。优化过滤器以实现高吞吐量回收仍然是一个挑战，因为它还取决于正在处理的AAV血清型。连续过滤作为一种分离技术可能会减少过滤器堵塞，但该技术尚未在行业工作流程中实施。由于缺乏适用于基因治疗产品的适当尺寸过滤器，过滤过程中的大容量保持和产品损失也是一个问题。当前的下游操作由于缺乏稳健的纯化过程，导致病毒回收率非常低。典型的色谱方法包括亲和和离子交换色谱（IEC）。虽然亲和色谱能够产生高产量的纯化AAV，但它不能区分空衣壳和满衣壳。最大的挑战之一是每种AAV血清型都需要特定亚型的纯化方法，以在保持产品效力和完整性的同时实现最佳产量。在下游处理中，需要在保持效力和产量目标的同时，分离病毒颗粒和减少过程和产品相关杂质。行业需要一个平台纯化过程，可以用于各种病毒载体，并可能减少纯化过程中的单元操作数量。此外，重要的是在下游过程的所有阶段最小化衣壳蛋白的物理和化学降解（如聚集、蛋白水解、氧化和脱酰胺），以便病毒感染效率不应受到影响。造成巨大损失和重大损害的一个原因是使用次优的缓冲液条件，这些条件不能在复杂的AAV制造过程中保持AAV的完整性。不涉及病毒产品捕获和洗脱的流过过程可以提高生产力和产品产量。能够选择性捕获宿主细胞蛋白和其他杂质的新型树脂也将有助于实现高纯度产品。空衣壳被视为杂质，因为它们要么完全缺乏基因组材料，要么只包含基因组片段。空衣壳的存在可能因为增加最终产品的免疫原性风险而影响AAV载体产品的效力和安全性。由于它们在电荷和大小上相似，将空衣壳与满衣壳分离是具有挑战性的。广泛使用的两种分离满衣壳和空衣壳的方法是铯氯和阴离子交换色谱（AEX）。铯氯梯度法是早期产品开发的主要方法，产生原始材料。然而，可扩展性困难，设备昂贵，技术对操作者的微小错误不容忍。这些问题继续推动行业走向更熟悉的基于色谱的分级方法，但这代表了一个非常大的挑战。空衣壳和满衣壳之间的表面差异程度在最好的情况下是适度的，并且因血清型而异。目前用于分离空衣壳和满衣壳的IEC通常使用极端pH和高导电性的洗脱条件，这有时会损坏病毒载体。在IEC色谱图中，空衣壳和满衣壳峰的显著重叠是常见的，这意味着要使用这种方法完全消除空衣壳，需要牺牲一些满衣壳。在分离过程中暴露于极端pH值可能导致衣壳稳定性受损，这是一个潜在的问题。扩展到具有线性梯度能力的工业色谱架是简单和稳健的，但在只有步进梯度能力的色谱架上，性能可能会受到影响。很少有商业树脂能够分离满衣壳和空衣壳。显然，需要一个稳健的平台分离技术，适用于各种AAV，并能提高整体产品产量。AAV载体的配方目标包括在制造和储存货架寿命期间维持载体的稳定性和活性，以及实现体内目标组织的最佳转导。配方和灌装/完成过程包括配方设计、使用瞬时流过滤（TFF）进行浓缩和透析至最终配方，以及灌装/完成。配方开发工作流程包括确定与最大稳定性相关的缓冲液和pH值，然后筛选辅料以获得最佳稳定性和效力。这些研究包括在各种压力条件下进行强制降解，以了解降解途径并开发稳定性指示方法。典型的压力条件包括加速温度、冻融、光照、低pH和高pH、剪切应力、强制氧化和脱酰胺。辅料的选择取决于降解机制的识别。配方和灌装/完成单元操作的主要挑战是确定适用于基因治疗产品（例如，静脉内（IV）、皮下、脊髓内、视网膜下）不同给药途径的溶液条件，并在制造、无菌灌装/完成操作和储存过程中最小化产品降解。在制造、储存和使用过程中，AAV的聚集和效力丧失是主要问题。由于结构稳定性差和次优的配方缓冲液条件，许多情况下，AAV产品目前储存在冷冻条件下。浓缩的AAV库存易于聚集，这可能导致纯化损失和AAV测试的不一致性。聚集和表面吸附的AAV颗粒可能在制造过程中发生，这取决于工艺和溶液条件。此外，聚集可能改变体内给药后载体的生物分布或免疫原性。与多剂量重组蛋白治疗剂相比，AAV的免疫原性风险可能在只需要单剂量AAV治疗的情况下较小，但对于免疫力已经受损的患者不能忽视。AAV产品浓度的增加导致聚集和粘度增加，使得这些产品难以以小体积浓缩载体给药至某些部位，如中枢神经系统。AAV的其他降解途径包括蛋白水解和/或化学修饰，如氧化和脱酰胺。病毒载体可能在生产、纯化和给药过程中与各种表面非特异性结合后展开和变性。非特异性吸附和展开也可能在通过行政设备进行产品交付期间发生。使用辅料稳定AAV药物产品至关重要，特别是对于临床应用，其中将少量高浓度载体引入眼或脑等有限空间。需要使用低杂质和内毒素的辅料来控制降解速率，以解决这些问题，因为它们已被证明对其他生物治疗剂非常有效。AAV的前三条降解途径是：(1) 冻融引起的展开和活性丧失，(2) 在低离子强度下AAV的聚集，以及(3) 剪切引起的展开、聚集和沉淀。AAV稳定性对冻融敏感。病毒载体因冻融而变性、形成聚集并丧失活性。冻融稳定性也可能与缓冲液组分（如磷酸钠缓冲液）的结晶或缓冲液pKa的温度依赖性导致溶液pH值变化有关。与pH相关的结构变化在AAV1和AAV6中报告，当pH值从7.5降至4.0时，衣壳蛋白的α-螺旋结构逐渐丧失。AAV载体倾向于在低离子强度溶液中聚集。在一份报告中，AAV2的流体动力学半径随溶液离子强度的增加而减小，然后趋于平稳，表明静电吸引是AAV聚集的主要驱动力。AAV病毒载体在空气-水界面暴露于剪切应力时会展开和聚集。通过在AAV配方中使用非离子表面活性剂可以减少剪切引起的损伤。至少有两份报告证明了在非离子表面活性剂配方下，AAV2病毒产品损失的抑制。封装在病毒衣壳中的基因材料的稳定性也是制造AAV药物产品时的一个关注点。在非生理条件下，水溶液中的核酸不稳定；pH和离子强度破坏DNA螺旋并导致变性。其他挑战包括血清核酸酶敏感性、快速肾脏清除、巨噬细胞摄取。一项研究报告称，在制造过程中AAV8衣壳中的基因材料对DNase I杂质敏感。病毒载体可以在灌装/完成操作期间因剪切应力而聚集并形成颗粒。用于制造小体积基因治疗产品的灌装设施通常是半自动的，引发了与压盖和密封相关的错误问题。使用封闭系统中的蠕动泵技术的低剪切灌装操作将是有利的。这些封闭灌装设备需要确保无菌，因为由于产品损失，对病毒载体执行重复的无菌过滤是不可能的。实时无菌测试和封闭的端到端流程将为长期解决这些问题提供潜在解决方案。病毒载体在制造、储存、运输和处理过程中可能面临各种挑战，这可能影响AAV产品的安全性和有效性。AAV的降解途径可以分为两大类——物理和化学不稳定性。病毒载体的降解取决于溶液条件，特别是pH值、离子强度以及原材料/辅料污染物，以及外部因素，如温度、剪切应力、冻融和光照。物理不稳定性指的是AAV高级结构的变化。物理降解不涉及衣壳蛋白的共价修饰。物理不稳定性有三个主要途径——变性/展开、聚集和表面吸附。载体的物理不稳定性可能对AAV产品的稳定性和转导效率产生不利影响。如果由于非天然结构，降解产物具有毒性或免疫原性，则AAV制剂的安全性也会受到损害。变性是指AAV失去其天然结构，无论是二级、三级或四级结构的丧失。展开/再折叠可能发生在衣壳蛋白表达和生产过程中。病毒载体可能因剪切应力而变性和展开。它可能在制造和储存过程中吸附到表面上而变性，或者在剂量准备过程中稀释，或在给患者注射/输注过程中吸附到输注/注射装置上而变性。展开的衣壳蛋白在再折叠过程中更容易聚集，可能导致制造过程中滴度的丧失。许多因素，如温度、蛋白质浓度、变性剂的类型和浓度、pH值、离子强度、再折叠催化剂、硫醇/二硫剂和各种添加剂，已被发现影响蛋白质在再折叠过程中的聚集。剪切应力诱导的病毒颗粒完整性丧失和病毒回收率降低已被报道。热和pH诱导的AAV1变性中，VP蛋白发生局部展开而非整个衣壳降解。在这种情况下，pH诱导的变性被发现是可逆的。在另一份报告中，观察到AAVrh32.33、AAV9和AAV5的衣壳蛋白热诱导变性。在一项关于四种不同类型的AAV变性的相关研究中，AAV2被发现是热稳定性最差的，其次是AAV8、AAV1和AAV5。聚集是一个复杂的现象，可以通过许多不同的机制发生。聚集可能发生在展开或大部分未结构化的蛋白质的结合上，也可能发生在天然蛋白质的自我结合或寡聚化上。浓缩的AAV库存易于聚集，这可能导致纯化损失和AAV测试的不一致性。聚集也可能由于溶液或环境条件的变化而发生。蛋白质聚集体是生物制剂的主要关注点，因为它们可能引起免疫反应。病毒载体在组成内的聚集倾向导致了与增加的多分散性和随后感染力丧失相关的不均匀尺寸分布。这反过来导致治疗效果的显著降低，甚至可能导致不良反应。溶液条件显著控制了AAV2的聚集。AAV聚集也与较低的离子强度有关，表明需要最小离子强度来减少AAV聚集。还报道了限制AAV载体给药后转基因表达的免疫反应。通过用核酸酶处理有效去除残留的载体表面宿主细胞DNA，已被证明是减少聚集的有效策略。病毒载体在制造过程中可能会吸附在管道、玻璃、塑料和不锈钢表面，以及药物产品容器/封闭系统上，导致表面诱导的聚集。这些物理降解过程导致蛋白质分子在表面上积累和粘附。在这个过程中，蛋白质分子改变了它们的物理状态和构象。不同的表面吸附机制存在，驱动吸附的主要因素包括分子内力、疏水性、离子和静电相互作用。病毒载体衣壳蛋白和其他蛋白治疗剂一样，可以吸附到包括界面应力的各种表面上，导致蛋白质展开、聚集和沉淀，并减少溶液中的AAV浓度。错误折叠的衣壳蛋白可能暴露出通过疏水相互作用促进蛋白质聚集的疏水残基。这些相互作用可能导致小聚集体的形成，这些聚集体又可能进一步引发AAV聚集，最终在溶液中产生可见颗粒。在一项研究中，由于AAV载体的表面吸附，在使用1毫升注射器给药时，高达75%的载体损失发生，并报告了剂量的显著减少。在另一项临床前研究中，AAV5在玻璃和塑料表面上表现出显著的吸附。在剂量准备和给药期间观察到rAAV2-REP1（Rab Escort Protein-1）在给药装置上的非特异性吸附。化学降解指的是涉及通过化学键形成或解离来修饰蛋白质的过程，从而产生新的化学实体。AAV衣壳蛋白的化学修饰可能影响载体的安全性和有效性。蛋白质中主要的化学降解途径包括二硫键交换、脱酰胺、氧化和异构化。化学降解通常改变蛋白质的物理性质，如静电、疏水性、二级和/或三级结构，以及热力学和动力学展开/折叠障碍。不正确的二硫键形成/交换是蛋白质治疗剂常见的化学降解途径之一。这种降解途径可以在各种加工步骤中容易发生。蛋白质中的游离半胱氨酸残基可以被氧化形成二硫键连接或导致二硫键交换，引起蛋白质聚集或聚合。二硫键形成是pH依赖的，通常是由于配方pH的增加而产生的。AAV衣壳蛋白包含在序列位置上高度保守的五个半胱氨酸，位于230、289、361、394和482，它们在衣壳内大部分被埋藏。分子建模研究表明，Cys 230和394是完全保守的，但Cys 289、361和482可能对二硫键形成是可有可无的。可以想象，由于在VP亚基中观察到某些半胱氨酸残基之间的接近，可能会形成二硫键。二硫键可能对蛋白质的功能有无影响，这取决于它们在蛋白质和衣壳结构中的位置。在极端溶液条件下，衣壳蛋白可能经历脱酰胺，从而导致活性丧失。衣壳蛋白的脱酰胺有可能导致载体异质性。当天冬酰胺或较少的谷氨酰胺侧链的酰胺基团在相邻主链酰胺的亲核攻击后丢失时，就会发生脱酰胺。这个过程导致琥珀酰中间体，通过水解，产生一种由天冬氨酸和异天冬氨酸（或谷氨酸和异谷氨酸）组成的混合物。脱酰胺动力学取决于肽链的局部柔性、整体蛋白质结构、溶剂可及性、缓冲液身份、pH和温度。特定氨基酸的脱酰胺调节了重组蛋白治疗剂的稳定性和免疫反应。在AAV1、AAV3B、AAV4、AAV5、AAV7、AAV8、AAV9和Rh32.33血清型中报告了天冬酰胺残基的脱酰胺，并且指出脱酰胺的程度取决于载体的年龄和多种因素，包括氨基酸序列和三维衣壳蛋白结构。然而，脱酰胺的程度在很大程度上独立于载体的回收和纯化条件。与AAV8的脱酰胺速率相关联的载体转导活性的丧失。AAV8的LC-MS分析也证明了衣壳蛋白的脱酰胺。氧化是另一种常见的化学修饰，可能影响病毒载体的安全性和有效性。衣壳蛋白在下游处理或储存期间有能力氧化，从而影响病毒的感染效率。易受氧化的氨基酸主要包括Met、Tyr、Trp、His和Cys。像AAV这样的非包膜肠道病毒可能在自然环境中受到外部压力的伤害，因此对病毒衣壳蛋白的潜在损伤可能导致病毒无法识别细胞受体以启动病毒生命周期。研究表明，5°C长期储存24个月期间病毒颗粒损坏的主要原因是自由基氧化，通过添加金属螯合剂和羟基自由基清除剂（如EDTA和组氨酸）的组合加以限制。AAV8的甲硫氨酸氧化在LS-MS研究中有所报道。蛋白质中最常见的异构化是异天冬氨酸的形成，这是通过天冬氨酸的琥珀酰中间体的水解而产生的异构化。琥珀酰是天冬氨酸变为异天冬氨酸的中间步骤。琥珀酰中间体的pH依赖形成可以从Asn脱酰胺或Asp脱水中发生。异构化在AAV病毒载体中很普遍，并且在AAV5在各种压力条件下都有报道。目前，大多数临床和商业AAV产品都储存在冷冻条件下，因为它们在冷藏条件下没有长期储存稳定性。例如，Luxturna和Zolgensma都储存在冷冻条件下，它们在冷冻条件下的货架寿命仅为一年。由于耗时且昂贵的冻融程序以及冻融过程中可能发生的聚集和效力丧失，病毒载体的冷藏储存是非常理想的。例如，AAV2的稳定性是在4°C储存5天后以及在-20°C和-80°C下经过1、5和10次冻融周期后的病毒粒子尺寸分布来衡量的（见图4）。在4°C储存5天后，粒子尺寸分别增加了2倍、6倍和10倍，在-20°C下经过10次冻融周期，以及在-80°C下经过10次冻融周期。在另一项研究中，AAV1载体的稳定性在4°C储存7周后显示出20%的效力降低。然而，系统地努力优化液体病毒载体配方和稳定性的报道很少。冻干配方可能是实现AAV产品所需产品质量属性和储存条件的另一个选择，但尚未被显著探索。这可能是因为基因治疗领域是新的，开发者急于将其带到临床，而不是花费时间和精力去理解机制细节并优化AAV制造过程。通过优化溶液条件和添加辅料进行合理配方设计可以显著增加AAV稳定性，从而延长货架寿命。辅料对重组蛋白的有用性已有广泛报道，辅料也可以类似地在病毒载体的安全性和有效性中发挥重要作用。然而，缺乏合理、方法论结构化和系统的辅料选择方法。图4. AAV2载体的冻融稳定性：在140 mM NaCl，10 mM 磷酸钠，5% 山梨醇，pH 7.3 缓冲液中，4°C下以及在-20°C和-80°C下经过1、5和10次冻融循环后，以粒径大小（流体动力学半径，Rh）监测AAV2的稳定性。数据总结自Wright等人的研究。辅料增加溶解度并减少生物制剂的物理和化学不稳定性。稳定剂包括各种分子，包括糖、盐、聚合物、表面活性剂和氨基酸。这些辅料对溶液中蛋白质稳定性的影响主要是由于它们与蛋白质和容器表面以及水的相互作用。一些辅料通过直接结合稳定蛋白质溶液，而其他辅料涉及与蛋白质分子的间接相互作用。在干燥状态的冻干配方中，稳定化是通过辅料与蛋白质分子的直接相互作用发生的。辅料稳定病毒衣壳蛋白组装的类似机制已被观察到。渗透剂是小有机化合物，广泛用于稳定蛋白质免受变性和聚集。在水溶液中的蛋白质存在于折叠（F）和展开（U）状态之间的平衡。稳定化是通过优先排除机制发生，其中渗透剂将平衡移向F状态。在生物制药配方中最广泛使用的渗透剂是蔗糖、甘氨酸、甘露醇、组氨酸、葡萄糖、精氨酸、海藻糖和乳糖。渗透剂稳定AAV的类似机制存在。糖还可以显著提高载体产量。例如，细胞培养基中存在0.2M蔗糖已分别将AAV2和rAAV2-retro血清型的产量增加了1.9倍和1.5倍（见图5）。这可能是由于在严峻的下游纯化过程中蔗糖稳定AAV。有趣的是，蔗糖处理对AAV5产量没有影响。鉴于其广泛的可用性、低成本和易用性，AAV制造商可以采用蔗糖来提高制造产量和稳定性。图5. 蔗糖对大规模生产中经蔗糖处理后AAV产量的影响。AAVpro 293T细胞三重转染含有转移质粒、编码rep和血清型特异性cap基因的质粒以及编码腺病毒辅助序列的质粒。第二天，培养基被新鲜DMEM替换，有或没有0.1 M 蔗糖。对于每种血清型，计算了不同制备的AAV基因组拷贝（GC）的范围和平均数，并进行了绘图。数据总结自Rego等人的研究。缓冲剂和pH强烈影响病毒衣壳蛋白的构象和胶体稳定性。蛋白质只在非常狭窄的pH范围内稳定。pH决定了蛋白质分子的净电荷和静电相互作用的性质。通常，净电荷越高，由于静电排斥，聚集倾向越低，胶体稳定性越高。缓冲剂类型和pH可以影响载体稳定性和感染力。已报道AAV衣壳的pH结构变化。当pH从7.5降低到4.0时，AAV1和AAV6的衣壳蛋白VP1域的α-螺旋结构逐渐丧失；当pH重新增加到7.5时，这种结构变化被逆转。在低浓度缓冲剂中稀释AAV也可能导致载体聚集，如在AAV2在低浓度磷酸盐缓冲剂中稀释时所报道的案例。在低pH值下稳定性差使磷酸盐缓冲剂在冷冻条件下储存病毒载体时不适用，因为磷酸盐缓冲剂的pH值可能在冷冻时由于磷酸二钠在-20°C以下选择性沉淀而降低多达3个pH单位。缓冲剂可以显著影响AAV的热稳定性和转染效率（见图6）。不同缓冲剂对每种血清型有不同的影响，没有单一缓冲剂对所有病毒具有一致的稳定化或不稳定化作用。对于AAV8，转染效率被发现与缓冲剂类型无关。图6. (a) 通过差示扫描荧光法（DSF）确定的不同AAV血清型在常用缓冲液中的热熔解温度。分散的点表示每种AAV血清型在不同缓冲液中的熔解温度分布。缓冲液的组成为PBS：10 mM Na2HPO4，1.8 mM KH2PO4 pH 7.4，27 mM KCl和137 mM NaCl；CiPO4：0.2 M Na2HPO4和0.1 M柠檬酸pH 7.4；HEPES：50 mM HEPES pH7.4，150 mM NaCl和2 mM MgCl2；Tris：20 mM Tris-HCl pH 7.4，150 mM NaCl和2 mM MgCl；LR：27.7 mM 乳酸钠pH 6.5，102.7 mM NaCl，4.0 mM KCl和1 mM CaCl2；BSS：109.5 mM NaCl，10.1 mM KCl，3.3 mM CaCl2，1.4 mM MgCl2，28 mM 醋酸钠和5.8 mM 柠檬酸钠pH 7.4，0.02% 吐温和UB：20 mM HEPES，20 mM MES，20 mM 醋酸钠，pH 7.4，150 mM NaCl和5 mM CaCl2。(b) 在柠檬酸缓冲液中，AAV1、AAV2、AAV5、AAV6.2、AAV8和AAV9病毒载体的热熔解随pH值变化的情况，通过荧光方法测量。结果以三个独立实验的平均值±标准差给出。数据总结自Bennett等人和Pacouret等人的研究。pH对AAV1、AAV2、AAV5、AAV6.2、AAV8和AAV9病毒载体的热稳定性的影响在不同pH值的柠檬酸缓冲液中进行了评估，范围从7到3（见图6）。AAV载体的熔解温度在pH值变化时受到显著影响，并且以血清型依赖的方式。AAV1、AAV6.2和AAV9在pH 5和pH 7之间的熔解温度相似，在pH 3和pH 5之间显著降低。AAV2和AAV8的熔解温度在pH 5时达到最大值，而AAV5的熔解温度在pH 7到pH 3之间逐渐降低。在另一项研究中，使用差示扫描荧光热分析法（DSF）确定了AAV1、AAV2、AAV5和AAV8的pH依赖性热熔解温度。所有AAV血清型的热温度随pH值变化。相同的研究还通过Luciferase Assay System（Promega）检验了AAV1、AAV2、AAV5和AAV8的转染效率作为pH值和储存时间的函数。结果显示在图7中。在不同pH值和温度下预孵化24小时后的rAAV-Luciferase载体的细胞转导显示了所有AAV血清型转导效率的类似趋势。在-80°C和4°C储存的样本中，最高的转导水平分别在pH 7.4和6.0观察到。较高的温度和低pH储存条件使转导效率降低了80%以上。在所有血清型中，rAAV5最容易受到低pH储存条件的影响。在pH 2.5时，所有病毒在-80°C储存时至少失去了20%的转导效率。较高的储存温度进一步减少了转导效率的损失，37°C储存24小时的样本中没有检测到转染。这些数据表明，配方的pH值可能对AAV稳定性有重大影响。图7. pH值和温度对AAV转导的影响：(a) rAAV1，(b) rAAV2，(c) rAAV5，和 (d) rAAV8（全部包装了荧光素酶基因）在HEK293细胞中被病毒感染，病毒在柠檬酸-磷酸缓冲液中孵育24小时，pH值和储存温度如指示。每种AAV血清型的转导效率相对于在pH 7.4和-80°C储存的病毒显示。实验进行了三次重复，显示为平均值+标准差（n = 3）。数据总结自Lins-Austin等人的研究。盐对衣壳蛋白稳定性的影响是复杂的。盐可能对蛋白质稳定性有稳定、不稳定或无影响，这取决于盐的类型和浓度、离子相互作用的性质以及蛋白质中带电残基之间的静电相互作用。盐对蛋白质稳定性的影响可能是由于非特异性（Debye-Hückel）静电屏蔽，和/或通过特定离子与蛋白质结合。在低浓度下，盐影响蛋白质中的静电相互作用。因此，当存在导致蛋白质展开的排斥相互作用时，这种效应可能是稳定的，或者当蛋白质中存在稳定的盐桥或离子对时，可能是不稳定的。在高盐浓度下，静电相互作用饱和；盐的主要作用是影响溶液的溶剂性质。稳定盐增加水-蛋白质界面处的表面张力，并通过使疏水基团远离水分子来加强疏水相互作用，诱导蛋白质的优先水合。盐效应强烈依赖于盐浓度和溶液pH，因为pH决定了蛋白质组中可离子化氨基酸的带电状态。对AAV2载体聚集作为盐浓度和类型的函数进行了详细分析（见图8）。多价离子的盐需要较低浓度就能防止聚集，而高浓度的NaCl则需要。例如，大约200 mOsm的硫酸镁可以防止聚集，而要达到类似的效果则需要大约350 mOsm的NaCl。柠檬酸盐、硫酸盐和磷酸盐的钠盐在它们的效力上是中等的。这些数据表明，溶液的离子强度，一个取决于电荷价数以及盐浓度的参数，是影响载体聚集的辅料特征。通过Mg2+（20 mM）提高AAV2（pH 4.5至7.5）的溶解度也有报道；然而，没有观察到与多电荷阴离子（柠檬酸根3+）的溶解度提高。图8. 盐的种类和浓度对AAV聚集的影响。通过动态光散射（DLS）测量在含有不同盐类的10 mM 磷酸钠 pH 7.5中稀释后的AAV2载体的平均粒径。实心圆圈：氯化钠；空心圆圈：柠檬酸钠；实心方块：磷酸钠；空方块：硫酸钠；倒实心方块：硫酸镁；空心菱形：甘油。数据总结自Wright等人的研究。蛋白质在剪切应力下或暴露在空气-水界面时可能会展开、聚集甚至沉淀，导致可溶性和不溶性聚集体的形成。摇动增加了溶液中空气/水界面的面积。由于空气/水界面是疏水性的，蛋白质在界面处重新定向，并暴露出疏水区域，以最大化与界面的相互作用。蛋白质中疏水区域的暴露增加了蛋白质-蛋白质间分子相互作用的机会，因此，增加了蛋白质聚集的机会。衣壳蛋白的聚集可能会在AAV产品中引起免疫反应。非离子表面活性剂如聚山梨醇酯80、聚山梨醇酯20和泊洛沙姆188可以通过与蛋白质竞争表面上的吸附位点来保护蛋白质免受表面诱导的损伤。市场上的AAV产品，Luxturna和Zolgensma，在它们的配方中使用泊洛沙姆188。然而，使用时需要谨慎，因为表面活性剂中的杂质可能对生物治疗剂的质量产生不利影响。此外，表面活性剂的质量被怀疑会导致患者注射部位疼痛和过敏反应。在相关的案例研究中，评估了在Pluronic F68（PF-68）存在下，从PBS缓冲液中的浓缩库存溶液稀释后的AAV2载体的回收率，有无PF-68后通过三种不同的注射装置（见图9）。含0.001% PF-68的配方回收率分别为106%、104%和96%，而不含PF-68的分别为51%、24%和27%。在另一个例子中，含有0.001% Pluronic F-68、5% 山梨醇和0.25% 牛血清白蛋白（BSA）的AAV9已被证明可以抑制血友病B和Leber先天性黑蒙（LCA）基因治疗临床试验中AAV衣壳对容器和仪器表面的吸附。在另一个例子中，评估了通过注射装置模拟临床情景前后rAAV2-REP1（Rab Escort Protein-1）的生物相容性和稳定性。使用含有0.001%非离子表面活性剂（PF-68）的配方缓冲液或平衡盐溶液（BSS）准备剂量。PF-68配方剂量在两个不同的剂量水平上制备；然而，BSS缓冲液仅在一个剂量上进行了测试。测量了从基线下降的滴度百分比（见图9）。用BSS稀释的样本在所有时间点上都发生了显著的基因组滴度损失。添加0.001% PF-68在两个剂量水平上都防止了损失。图9. (a) 腺相关病毒2型（AAV2）载体在稀释和通过给药装置后的恢复情况。浓缩的AAV2载体库存被稀释到含有0.001%普朗尼克F-68（+PF68）或不含普朗尼克F-68（-PF68）的磷酸盐缓冲液（PBS）中，并吸入1毫升注射器。载体溶液通过三种不同的装置（A、B和C）。通过后，通过定量聚合酶链反应（Q-PCR）测量恢复载体的浓度。(b) 在几个时间点，通过外科手术器械稀释和通过后的rAAV2-REP1载体样品的滴度被测量。收集的所有样本在每个时间点的平均滴度与基线的差异。符号代表三个重复的平均值±标准差，除了1E+12颗粒/毫升剂量，那里只考虑了两个重复。数据总结自Bennicelli等人[79]和Patricio等人的研究。肽氧化是化学不稳定性的主要原因，有时也与物理不稳定性有关。肽中的氨基酸，如甲硫氨酸、半胱氨酸、组氨酸、酪氨酸和色氨酸容易氧化。衣壳蛋白在暴露于光线和原材料及辅料中金属离子杂质时可能会氧化，导致功能丧失。可以使用游离氨基酸如甲硫氨酸和组氨酸以及金属离子清除剂如乙醇、EDTA和DTPA来防止氧化。金属离子的性质也显著影响AAV配方的质量。在另一个例子中，测试了AAV5的热稳定性。AAV5对甲硫氨酸氧化敏感，数据还显示在37°C储存时感染力损失显著减少。病毒载体的稳定性和临床性能可以通过化学修饰来改变。用丙氨酸或精氨酸突变AAV2衣壳中的丝氨酸、苏氨酸和赖氨酸残基已被证明可以提高转导效率。通过突变VP3序列并引入非天然氨基酸，将重氮基团引入AAV衣壳，据报道可以修改AAV特异性。最近，报道了将功能化的RGD肽嫁接到基因修饰的AAV衣壳上，以特异性靶向肿瘤细胞。PEG化通常用于改善蛋白质药物的药代动力学和药效学，并且在病毒载体保护中进行了研究，包括AAV生产。将重氮基团结合到AAV衣壳蛋白后，通过点击化学与各种聚乙二醇（PEGs）进行正交和计量共轭，已被证明可以在人血清池中提高1.7到2.4倍的稳定性，并几乎减少两倍的抗体识别。通过胺功能化的PEG化的AAV2颗粒已被证明可以保护病毒免受中和，并在不损害患者免疫系统的情况下，在重新给药时实现显著水平的基因表达。与PEG 2000偶联的rAAV2在存在中和抗体的情况下，以1000:1的比例显示出2.3倍的转导效率增加。这篇综述总结了当前对AAV生产工作流程的理解以及在使AAV药品制造成本效益方面遇到的挑战。AAV载体在生产、储存、运输和处理过程中经历了各种压力条件，导致产品质量次优和货架寿命缩短。本综述还讨论了AAV病毒载体制造商在生产和长期储存期间所经历的挑战以及可能的缓解策略。基因治疗制造商今天遇到的挑战与单克隆抗体制造商在抗体治疗剂出现时所经历的挑战类似。例如，单克隆抗体也面临着在制造、储存和处理过程中低滴度、产品和过程相关杂质以及降解的挑战。尽管与重组mAbs相比，单剂量AAV产品的与过程相关的杂质的风险可能较低，但不能忽视，将取决于杂质的类型、剂量和给药途径。由于这些相似之处，药物制造商、化学品和辅料供应商有机会合作，开发创新的解决方案，实现强大且成本效益的AAV产品制造。为了充分利用基因治疗产品的潜力，有必要在制造过程工作流程中开发新的和更好的技术。下面讨论了AAV制造商目前经历的一些主要挑战以及可能的缓解策略：上游过程涉及贴壁细胞系和三重转染，导致产品滴度低和产品质量高变异性。它还限制了规模扩大，只能通过平行培养板有限增加容量，这不是长期解决方案。血清型特异性的纯化策略对制造商来说是一个挑战。目前尚不存在一种适用于所有AAV血清型的统一纯化方法。这导致产量降低、成本增加和产品质量下降，进而导致临床研究的延迟。对AAV的降解机制了解有限，且缺乏任何系统的配方开发方法。尽管有报道称在制造和储存过程中发生了聚集和效力丧失，但关于最小化或控制它的讨论有限。AAV 基产品的保质期有限，通常为12-18个月，且需要冷冻条件进行储存和运输。这使得库存管理和供应链变得非常复杂。简化上游过程的策略包括开发稳定的AAV生产悬浮细胞系，这些细胞系不需要三重转染，或者利用其他无质粒的创新技术。能够显著提高滴度和满/空衣壳比率的创新转染技术也是一个有吸引力的替代方案。开发适用于各种AAV血清型的血清型无关的稳健纯化平台。目前的亲和色谱技术无法区分满衣壳和空衣壳。具有对满衣壳选择性的树脂将是病毒载体下游工作流程的突破。这将消除下游工作流程中空衣壳分离单元操作的需求。进行各种压力条件下的强制降解研究，以了解AAV病毒载体的降解机制。一旦收集到足够的知识，就有可能制定有效的配方开发策略，以控制选定储存条件下的降解速率。开发创新的配方策略，通过探索现有辅料或开发新型辅料来最小化降解速率。这将为成品提供更长的保质期，并可能实现在冷藏条件下的储存、运输和处理。识别微信二维码，可添加药时空小编
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