摘要：卡介苗已经存在了一个世纪，在结核病控制中发挥了重要作用。生产疫苗的方法在很长一段时间内没有改变，人们对通过生物反应器生产卡介苗的方式越来越感兴趣，这可以解决批间差异的一些问题，增加产量，并规避与供需相关的挑战。有证据表明，发酵将是一种更快、更具可重复性的生产方法，并将以一种更容易表征的形式提供更高产量的卡介苗。然而，对生产过程的改变可能需要新的生物等效性证据，并可能需要从I期临床前研究和临床试验，以及通过有效性研究。本章介绍了卡介苗的历史和当前生产方法的问题。我们讨论了卡介苗的生产方法，包括发酵、培养和制备。卡介苗发酵的潜在益处以及实施这种生产方法所需的监管步骤。
1.卡介苗：历史与批准
牛分枝杆菌卡介苗(Bacillus Calmette-Guerin)是一个多世纪前为预防结核分枝杆菌感染而产生的，是仍在使用的最古老的疫苗之一。卡介苗起源于从患结核性乳腺炎的奶牛的奶中分离出的牛分枝杆菌毒力菌株，这是在牛结核病研究中收集的。大约1901年，这种分离物被转移到法国里尔的巴斯德研究所，并被Albert Calmette和Camille Guerin用于分枝杆菌培养和结核病疫苗开发的潜在研究。这种生物很难培养，容易结块，使控制传代和生物管理具有挑战性。为了优化实验的细菌制备，Calmette在含5%甘油牛胆汁的马铃薯培养基上面培养牛分枝杆菌。几个月内，出现了一种独特的、衰弱的分离物，具有不寻常的菌落形态。Calmette和Guerin在接下来的13年(1908-1921年)继续对这种牛分枝杆菌菌株进行连续体外传代。在此期间，在豚鼠、兔子、狗、牛、马、鸡和非人类灵长类动物等不同动物模型上进行的实验，证实了卡介苗的安全性和有效性。1921年，Benjamin Weil-Hallé用小勺子给新生儿喂食少量卡介苗的方法接种疫苗。没有有害的副作用，最重要的是，这个孩子没有患上结核病，尽管婴儿的母亲在分娩后不久死于结核病。在接下来的一年里，更多的新生儿接种了疫苗，没有不良反应的报告。这是第一次有一种安全和明显有效的疫苗可用于预防人类结核病。1924年卡介苗的培养物就被巴斯德研究所分发到世界各地的实验室，巩固了其在抗击结核病斗争中的地位。由于卡介苗是一种活疫苗，因此每隔几周就必须将培养物转移到新鲜培养基中。尽管进行了标准化工作，但不同的生产实验室采用了不同的传代条件。卡介苗的体外变异被被持续关注到今天，出现了几十种不同的子株，目前主要使用的四种：巴斯德卡介苗(1173P2)、日本卡介苗(Tokyo-172)、丹麦卡介苗(Copenhagen-1331)和葛兰素卡介苗(1077)。
2.卡介苗培养和生产基本限制
目前的卡介苗生产时间很长(约21天)，同时需多重培养和加工，属于劳动密集型生产，标准化生产是难点，使卡介苗生产无法有效应对需求或短缺的变化。随着时间的推移，卡介苗生产商的数量也在减少，特别是在世界卫生组织(世卫组织)预认证供应商计划中，这使全球公共卫生大规模疫苗接种计划的卡介苗供应面临风险。就连为最近的结核病新疫苗临床试验获得卡介苗也是一个令人担忧的过程。2014-2015年，由于技术问题导致一个生产点停止生产，全球卡介苗短缺持续数月。薄膜生产方法也导致质量控制问题，细菌聚集意味着检测细胞滴度具有挑战性，并往往会产生高度变异的结果。
生产企业之间甚至生产企业内部的卡介苗批次差异也是一个关键问题。世卫组织指出，需要标准化卡介苗的生产和质量评估，不仅要减轻可检测的变异性，而且要使“新”和“旧”卡介苗临床试验的评估变得更容易。如果采用重组卡介苗中异源蛋白的表达，可能是具有可重复性和确定性以实现标准化的生产方法的好时机。目前的方法必须对块状细菌进行球磨粉碎，会导致死亡细菌的比例不确定，而这些死亡细菌可能导致卡介苗的质量下降、批次差异大。这反过来可能影响免疫/保护性反应的类型和疫苗的效力。以前曾用这种方法制备的卡介苗的生长速度较慢，还可能增加接种后疤痕和Mantoux试验PPD(纯化蛋白衍生物)阳性皮肤反应的发生率，这进一步支持了卡介苗表型是影响疫苗接种结果的变量。批次之间差异的定量测量仅有菌落形成数量的这一指标，不能提供有关培养活力或死亡细菌比例的完整信息。而其他可能因素(卡介苗菌株、暴露于环境分枝杆菌、不同的宿主免疫谱)的影响下，疫苗效力会有产生多大的影响尚不清楚，但一种一致和量化的方法肯定能为评估各类影响因素提供基础。不同培养方法和培养基组成毫无疑问影响疫苗的效力、生物体的生理状态和随后的免疫/保护性免疫反应。
3.发酵可否成为一种生产卡介苗的方法？
人们对通过在生物反应器中培养卡介苗来生产卡介苗的可能性越来越感兴趣，这可以解决批间差异和提高卡介苗产量。后基因组研究采用了在指定和控制条件下在趋化剂中发酵牛分枝杆菌BCG的方法，结合筛选情况，以确定适应慢速生长速率或快速生长速率的遗传要求。这些研究后来扩展到确定这些不同生长速率下大分子物质的清单，发现分枝杆菌细胞中脂质的比例在不同的生长速率下发生变化，可能反映存储脂质数量。使用指定培养条件发酵结核分枝杆菌的研究表明，发酵过程中的控制条件能减少异质性和增加培养的重现性。不同的研究者采取不同的方式开展研究工作，如：Dietrich等人在Sauton最小培养基中进行BCG薄膜生长，Pascoe等人采用高通气的摇瓶中控制生产处一致的接种量。Hendon-Dunn等人开发了一种流式细胞术方法，使用两种染料这使得活的或死的细菌的比例可以定量确定，并捕获不可培养的细菌。同时有研究确定Roisin培养基为发酵的最佳培养基，因为与Middlebrook 7H9相比有更好的的生长。Roisin培养基的优势是作为一种定义的培养基，可以对单个培养基组分进行定量替换。这为进一步优化发酵生产卡介苗的培养基创造了机会，以确定大规模发酵对卡介苗培养和动物模型保护/毒力研究的影响。
图1 在批量发酵剂中，800mL 7H9(a)或最小培养基(b)培养12天，发酵剂培养的牛分枝杆菌卡介苗的总活菌数。每天采集培养物进行总活菌计数（CFU mL−1）（a，b）和浊度(c).检测在第0、4、6、7和12天取样品，用荧光珠和粪便细胞术(d).测定总细菌计数（细菌/mL）在同一天采集样本，分别使用荧光细胞仪和树脂染料Sytox Green (e)和钙绿素紫am(f)分析细胞死亡和代谢状态。包括一个热杀死的牛分枝杆菌卡介苗对照。数据代表三个独立培养重复的平均值±标准误差条的平均值。（资料来源：Pharmaceutics 2020 Sep 22;12(9):900 doi: https://doi.org/10.3390/pharmaceutics12090900）
4.卡介苗的产品特性
卡介苗的悠久历史，与正在使用或临床研究的现代疫苗相比，卡介苗的检测项目清单是有限的，特别是批放行检测项目。同时卡介苗的研究也从国家监管机构(NRA)过渡到国际协调委员会（ICH）。在过去十年中，改进的技术为卡介苗产品特性提供了额外的途径，其中一些已经获得监管机构的关注，并被纳入指导文件。尽管从技术和检测方法开发的角度来看都取得了进展，但将一些新的检测方法纳入监管和批放行疫苗测试领域仍然存在障碍。为此，需要大量的投资和开发时间，以确保新方法提供有关卡介苗质量和功能的信息。ICH的建议是在批准和批准使用新方法之前，必须对新方法进行充分的测试，并对其进行必要的验证。ICH的一系列指南，提供了实验室和数据包框架，并要求将新的检测方法纳入监管环境。目前制造商和NRA使用的唯一可接受的卡介苗效力是使用各种技术对总细菌数量进行的存活计数和相对存活率的计算。这已被证明与临床结果有一定的关联，但没有确定直接的剂量反应曲线，相对效力难以量化。而体内评估(小鼠保护研究，豚鼠保护研究)是复杂的、长期的，不适合生产或批放行活动。因此，没有明确的证据证明检测结果和临床效果的有效性的联系。对卡介苗生产工艺进行重大改变，例如转向发酵，可能会改变产品的性质，同时对生产工艺进行重大重新设计可能会引发国家药监局的审查，并建议将发酵卡介苗视为一种新产品。新产品同时需要生物等效性的新证据，并可能需要进行临床前研究。世卫组织关于确保卡介苗质量、安全性和功效的建议指出，生产新的卡介苗(即改良的卡介苗菌株)是开展临床研究的先决条件，这给开发工作带来了巨大的挑战，同时对现有的卡介苗制造商造成负担。
表1 欧盟药典；目前的卡介苗检测建议
表2 新型或最近纳入的卡介苗特征试验
卡介苗对使用者和消费者来说，它仍然是一种低成本但有效的疫苗。2015年10月世卫组织在蒙特利尔进行了一次讨论，讨论如何将卡介苗生产转向更标准化和更现代化的生产工艺。国家结核病控制和预防中心、生产商和主要分枝杆菌专家的代表参加了会议。没有达成明确的前进方向，这体现了在卡介苗生产工艺上进行重大变革的复杂性，进一步限制了改进卡介苗生产和供应的可选方案。
5.结论
卡介苗生产的改进和优化已经进行了大量工作，包括生产培养基、补充剂和卡介苗表征方法，所有这些都受到了审查和评估。由此发表的研究向潜在的制造商或疫苗开发商提供了可用的方法，旨在解决卡介苗生产产量、可比性和一致性的问题。尽管进行了多次讨论，但似乎没有明确的途径通过采用发酵/生物反应器技术来改进目前已获许可的卡介苗生产工艺。这里有多种考虑因素，从监管限制到改变技术的成本，以及获得批准对生产程序进行重大改变的影响。随着COVID-19疫苗开发的压力和时间表的发展，可能会出现解决这些问题的新方法，这种监管环境更加灵活和务实，在创纪录的时间内有效地提供了有效和安全的疫苗。
参考资料：Vaccines for Neglected Pathogens: Strategies, Achievements and Challenges-Chapter 9.
