摘要：溶瘤腺病毒疗法作为治疗各种癌症的新型选择，正在变得越来越重要。已经识别出腺病毒载体内部的不同修改概念，这些概念定义了它们对肿瘤的作用方式和与肿瘤的相互作用。腺病毒载体允许进行基因操作，这些操作限制了肿瘤特异性，并且还可以表达特定的转基因以支持抗肿瘤效果。此外，病毒的复制和对邻近肿瘤细胞的再感染放大了治疗效果。溶瘤腺病毒疗法中的另一个重要方面是病毒诱导的细胞死亡，这是一个激活免疫系统对抗肿瘤的过程。本综述描述了在腺病毒载体中已识别的元素，这些元素的修改不仅用于将溶瘤腺病毒载体转化为条件复制腺病毒（CRAds），允许它们在肿瘤细胞中特异性复制，而且还赋予这些病毒特定特性。这些在开发中的进步导致了临床试验，这些试验根据概念设计进行了总结。
1.引言
近年来，溶瘤病毒的开发及其在临床试验中的实施受到了越来越多的关注。腺病毒是在溶瘤病毒治疗领域研究最深入的病毒之一，并且多项分子生物学的发现可以追溯到腺病毒研究。它们属于非包膜病毒类别，包含有26-48 kb基因组的线性双链DNA，基因组位于大约950 Å直径的二十面体衣壳内，不包括纤维，纤维的长度根据血清型不同在110到370 Å之间变化。人类腺病毒具有高遗传稳定性和低致病性。它们相对容易以高滴度和纯度生产。这使它们特别适合用于各种应用，从基因和癌症治疗到疫苗开发。腺病毒的生命周期是染色体外的，因此它们被认为是非整合型载体，可以感染复制和非复制细胞。根据它们的抗原特性，迄今为止已描述了50多种人类腺病毒的血清型，但最近的努力已揭示了104种已注册的基因型（http://hadvwg.gmu.edu/ （访问日期为2021年9月23日））。2型和5型在研究中最常用。使用复制缺陷型腺病毒的基因治疗仅限于表达转基因，并且在自杀基因治疗的情况下，仅限于杀死感染的细胞。另一方面，在溶瘤方法中，病毒会复制，随后感染的细胞裂解，并将新的感染单位释放到肿瘤环境中。腺病毒溶瘤作用的一个重要方面是，它对肿瘤干细胞也有效，肿瘤干细胞经常由于对治疗的内在抗性而引起肿瘤复发。
自20世纪90年代初以来，分子生物学和病毒学的复杂方法和进步导致了病毒载体开发的重新启动。特别是，表达腺病毒E1区的人胚肾细胞(HEK293)的建立对于开发第一代腺病毒载体至关重要，这些载体通过删除早期E1基因并为长达4.5 kb的转基因序列腾出空间而变得复制缺陷。HEK293细胞系中的E1区提供反式互补，并使腺病毒载体得以复制，使其成为一个可行的生产细胞系。这篇综述文章主要关注肿瘤特异性复制的溶瘤腺病毒载体的遗传工程策略，这是溶瘤作用的主要先决条件。它还描述了转基因表达和刺激免疫系统的方面。这些概念目前正在临床试验中进行测试，这些试验根据腺病毒载体设计进行总结，这将决定未来载体设计改进和与其他治疗选择结合的决定性方面。
2.实际临床试验中使用的四种主要条件复制腺病毒概念
腺病毒的复制周期可以分为两个阶段。相应地，腺病毒基因组被组织成早期(E1-E4)和晚期(L1-L5)转录单元，后者编码结构蛋白（图1）。早期区域1A (E1A)编码五种不同的蛋白，两个主要的异构体12S和13S需要早期复制。E1A 13S蛋白由289个氨基酸组成，具有四个保守区域(CR1-CR4)，可以转录激活其他早期转录单元E1B、E2、E3和E4，而E1A 12S缺少CR3。
图1. 野生型5型腺病毒基因组的结构以及在当前临床试验中应用的四种条件复制腺病毒生成概念。为了说明变化，受影响的E1区域被放大显示。大约36 kb长度的双链DNA（黑色水平箭头），两侧是两个倒置末端重复序列（ITR），包括四个早期转录单元（E1–E4，浅灰色框）和五个晚期转录单元（L1–L5，深灰色框）。E1区域（下方放大）由包装信号/E1A增强子、E1A启动子、E1A（含四个保守区域CR1–CR4）和E1B组成。四种概念列在下方：启动子变化（灰色）、Delta24（蓝色）在CR2中有缺失，XVir-N-31（紫色）在CR3中有缺失，ONYX-015（绿色）有终止密码子和E1B55K中的缺失。
E1 缺失的腺病毒被认为是复制缺陷型的，被用作基因治疗或疫苗接种中的穿梭载体。那些在癌细胞中复制受限的复制能力腺病毒因此被称为 CRAd（条件复制腺病毒），并在溶瘤腺病毒治疗中临床使用。目前临床腺病毒载体中实现条件复制的四种通用策略是：一种概念是用癌细胞特异性启动子替换或覆盖原生 E1 启动子，其他三种概念涉及早期转录单元 E1A 和 E1B 的修改。在许多构建中，E1A 修饰与肿瘤特异性启动子结合使用。然而，还有几种其他有前景的方法尚未在临床试验中测试。
2.1.特异性细胞启动子控制 E1A 和腺病毒复制
肿瘤特异性启动子的特征在于它们能够引起对恶性表型至关重要的特定基因的高表达。通过肿瘤或组织特异性启动子控制 E1A 介导的病毒复制，将复制限制在适当的细胞中。E1A 调控区域的缺失不应干扰倒置末端重复序列（ITR; 1–103 bp）或与 E1A 增强子区域重叠的包装信号（194–358 bp）。因此，外源性启动子通常插入到 E1A 调控区域中，没有任何或很小的缺失，保持 E1A 增强子/包装完整，如 CRAd-Survivin-pk7 。对于进一步的缺失，包装信号必须被挽救并在其他地方克隆，如 Ar6pAE2fE3F 和 CG0070 的情况。这允许更严格的复制控制。E4 区域的并行调节通过特定启动子也增加了特异性，因为 E4 基因产物对有效的病毒复制是必需的。为了控制 E1A 转录，使用了 E2F 响应元件、Survivin 的启动子、人类端粒酶逆转录酶（hTERT）或铬粒蛋白 A（CgA）。限制腺病毒复制到特定的肿瘤实体和组织也已成功实现。对于前列腺组织，使用了 probasin 启动子（驱动 E1A）和前列腺特异性抗原（PSA）的增强子元素（驱动 E1B）[21]，对于肝细胞癌（HCC），使用了甲胎蛋白（AFP）启动子。为 Ad2xTyr（一种溶瘤腺病毒，其 E1A 调控区域的部分以及 E4 启动子被替换）设计了一个合成的核心启动子和增强子融合构建。Ad2xTyr 显示出对黑色素瘤细胞与正常成纤维细胞和角质形成细胞的肿瘤选择性。
2.2.E1A 修饰控制复制的特异性
实现肿瘤特异性腺病毒复制的另一种方法是通过引入功能丧失突变来改变 E1 区域中的蛋白质编码基因。具有特定分子特征的癌细胞可以弥补这一缺陷，从而实现复制。
2.2.1.E1A 缺失：Delta 24
在非复制细胞中，视网膜母细胞瘤蛋白（pRB）作为 E2F 转录因子家族蛋白的负调节因子与之相互作用，从而控制细胞周期进展 。这条途径在肿瘤细胞中通常在遗传上被破坏。腺病毒 E1A 蛋白的 CR2 区域也与 pRB 相互作用，导致 E2F 的释放并使病毒复制。在 Delta-24 中，腺病毒 E1A CR2 中的 24 个碱基对的缺失阻止了 E1A 与 pRB 的结合。这种病毒不能在正常细胞中释放 E2F，也不复制。在 pRB 突变或调节异常的肿瘤细胞中，E2F 不再被 pRB 负调节，并且可以激活病毒基因转录，从而复制 。在 Ad5-Delta-24 的多种进一步开发中，通过肿瘤特异性启动子调节修改后的 E1A 区域。在 AdCN103 中，E1A 的 24 个碱基对缺失与修改后的 hTERT 启动子结合，在 SynOV1.1（Ad5-Delta-24-RGD-hGMCSF）中与增强的癌症特异性甲胎蛋白（AFP）启动子结合。在其他 Ad5-Delta-24 衍生物中，E1A 转录由一个或多个 E2F 响应元件控制，如 LOAd703（Ad5/35-E2F-Delta-24）、ICOVIR-5 和 -7（Ad5-E2F-Delta-24-RGD），以及 VCN-01（Ad E2F-Delta-24-RGD-PH20）。
2.2.2.E1A 13S 缺失：Dl520，Ad-Delo3-RGD（XVir-N-31）
腺病毒 E2 启动子可以分为早期和晚期启动子，用于调节 E2 转录单元，其中包括 DNA 聚合酶。晚期 E2 启动子区域包含 Y 盒，是转录因子 YB-1（Y 盒结合蛋白-1）的结合位点。已证明选择性病毒复制与 YB-1 表达相关。在恶性组织中展示了 YB-1 蛋白水平的升高和在细胞核中的亚细胞定位，并与预后不良和多药耐药性相关。在正常成人细胞中，YB-1 要么不表达，要么仅定位在细胞质中。由于 E1A13S 对 YB-1 从细胞质到细胞核的易位至关重要，缺乏 E1A13S 表达的腺病毒在正常细胞中复制缺陷。Dl520 是一种溶瘤腺病毒，由于 E1A CR3 的剪接接受位点缺失了 10 个碱基对，因此不产生 E1A13S。进一步的发展代表了 Ad-Delo3 RGD（XVir-N-31），它在 E1B19K 和 E3 中有额外的缺失，并在纤维蛋白中有 RGD 基序，目前正在作为胶质母细胞瘤的 I 期临床试验注册（EudraCT 编号：2016-000292-25）。
2.2.3.E1B55K 缺失：Dl1520（ONYX-015），Oncorine（H101）腺病毒基因组的 E1B 区域编码一种 55-kD 蛋白（E1B55K），它与 p53 结合并使其失活。这种结合被认为对病毒复制至关重要，可能是因为 E1A 触发 p53 依赖的凋亡。Dl1520 是一种嵌合腺病毒（Ad5/2），在 E1B55K 中有缺失并有一个终止密码子终止蛋白质的翻译，与 ONYX-015 相同。这种病毒的肿瘤选择性有限，从而挑战了这一概念。然而，基于这个载体，开发了变体 Oncorine（H101），它具有腺病毒 5 的基因组和部分缺失 E3，已经在中国获批用于临床应用。
3.溶瘤腺病毒与免疫系统
免疫原性细胞死亡的诱导已被证明是病毒疗法中的关键方面（图 2）。基于这一机制，溶瘤病毒可以逆转肿瘤免疫逃逸。研究表明，病毒诱导的溶瘤作用导致凋亡、坏死、坏死性凋亡、焦亡或自噬，释放具有病原体相关分子模式（PAMP）的信号分子。感染的细胞还释放损伤相关分子（DAMP），包括 HMGB1、热休克蛋白（HSP）、细胞内基质蛋白、DNA、ATP、尿酸、或肝素硫酸盐。这些分子刺激先天免疫反应并吸引抗原呈递细胞（APCs）。肿瘤微环境中的肿瘤相关抗原（TAA）和新抗原可以被 APCs 摄取，并触发针对肿瘤的系统性免疫反应，从而使“冷”肿瘤转变为被免疫系统识别的“热”肿瘤。因此，“溶瘤病毒疗法”和“溶瘤免疫疗法”这两个术语被同义使用。溶瘤腺病毒通过引起局部炎症、病毒传播、破坏肿瘤微环境和释放肿瘤抗原，多模态地作用于肿瘤，导致系统性抗肿瘤反应，从而实现肿瘤的完全根除。
图2. 溶瘤腺病毒在癌细胞中的作用机制。在正常的非癌细胞中，溶瘤腺病毒在感染后无法复制，使细胞不受影响。在肿瘤细胞中，病毒可以在感染后成功复制，导致产生更多的病毒后代并最终诱导免疫原性细胞死亡（ICD）。细胞裂解导致病毒后代、病原体相关分子模式（PAMP）、损伤相关分子模式（DAMP）和肿瘤相关抗原（TAA）释放到肿瘤微环境（TME）中。释放的病毒后代进一步感染未感染的肿瘤细胞并继续病毒传播。释放到TME中的免疫刺激性分子吸引免疫细胞到肿瘤并激活对肿瘤的先天和适应性免疫。
4.武装腺病毒载体以提高其治疗效果
除了组织特异性复制外，还开发了改善腺病毒的溶瘤和细胞毒性特性的载体系统。因此，删除 E1B19K 蛋白——一种阻断凋亡诱导的 Bcl-2 同源物已被证明可以增加病毒传播并增强 TNF-α 介导的细胞死亡。
4.1.在腺病毒载体中包含转基因的策略
除了保证癌症特异性复制的策略外，还引入了促进溶瘤或刺激免疫系统的基因。基于早期非复制载体系统开发的研究，大多数溶瘤腺病毒使用 E3 区域的缺失，因为该区域对病毒复制非必需，允许插入长达 8.3 kb。表达载体通常设计有外源性启动子，如人巨细胞病毒启动子或热休克蛋白 70 启动子。此外，可以使用核糖体进入位点、剪接接受位点或 2A 自切割肽连接子来调节转基因的转录。另一种方法是通过腺病毒 E3 启动子和 E3 聚腺苷酸化位点来调节插入的转基因。在这里，E3 腺病毒死亡蛋白（ADP）的存在增加了溶瘤效果。E3 区域的替代方案是将转基因定位在晚期基因中，这在特异性、表达水平和表达时机方面似乎有优势。将 hGM-CSF 插入晚期基因 L3 导致了该转基因的高表达水平，此外，这种表达还依赖于腺病毒 DNA 复制。相比之下，当转基因插入 E3 区域时，表达较弱且与复制无关。当 p53 与晚期基因（L5, 纤维）结合时，也观察到了类似的结果。
4.2.赋予改善治疗效果的转基因
为了增强溶瘤腺病毒的治疗效果，已经采用了多种方法，如基因导向的酶前药疗法（GDEPT）、增强病毒诱导的凋亡和病毒传播、表达特定基因和吸引免疫系统。
GDEPT 的优点是将无毒化合物局部转化为细胞毒素，从而最小化系统毒性。在溶瘤病毒疗法中使用的一些酶的例子包括与更昔洛韦联合使用的单纯疱疹病毒胸腺嘧啶激酶或与 5-氟胞嘧啶联合使用的胞嘧啶脱氨酶。其他可能性包括通过 RNA 干扰（RNAi）技术下调细胞基因。
溶瘤腺病毒颗粒在组织内的传播主要受到结缔组织的限制。因此，已经设计了表达能够消化细胞外基质的酶的病毒，例如，表达人透明质酸酶以降解透明质酸或表达融合性膜糖蛋白以诱导细胞融合。
在体内肿瘤环境中，通过增强抗肿瘤活性的 Ad5 突变体的生物选择作为选择压力，得到了变体 AdT1，它在 E3 gp19K 的内质网（ER）的保留域内有单一腺嘌呤插入，这导致病毒从感染细胞中释放增加。如上所述，腺病毒通常具有免疫原性，但可以通过武装溶瘤腺病毒以表达免疫刺激性因子的转基因来增强效果，如 TNF-α、IFNα、白细胞介素（IL）-2、IL-12、CD40L、OX40 配体（OX40L）或人类粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）。4-1BB 配体（4-1BBL, CD137L）被纳入 LOAd703，因为它已知可以增强免疫记忆并扩展自然杀伤（NK）细胞。对于 HER2 阳性癌症的治疗，将编码人类曲妥珠单抗重链和轻链抗体的基因插入腺病毒载体，并通过内部核糖体进入位点连接。在感染的细胞中，多肽组装成功能性抗体。免疫检查点抑制剂（ICI），已经在癌症治疗中成功使用，也已经以编码抗体的转基因形式纳入腺病毒载体，针对 T 淋巴细胞相关抗原-4（CTLA-4）或针对 PD-L1 的小抗体在共感染的辅助依赖性腺病毒（HDAd）中。
5.溶瘤腺病毒的递送和趋向性
系统应用腺病毒载体会导致所有器官特别是肝脏中的病毒摄取。静脉注射后，90% 的病毒在最初的 24 小时内被先天免疫系统的成分消除。肝脏驻留的巨噬细胞（Kupffer 细胞）特别有效地摄取并灭活血液中循环的腺病毒，导致在血液中的半衰期大约为两分钟。通过直接注射到特定器官，可以在某些器官中保留腺病毒。然而，在 Ad5 给药后的 14 天内，会发生针对病毒的特异性体液和细胞适应性免疫反应，清除病毒颗粒和腺病毒感染的细胞。
为了确保溶瘤腺病毒的有效抗肿瘤反应，必须考虑修改和递送方法以实现足够的病毒进入肿瘤细胞。
5.1.改变腺病毒趋向性以用于临床的遗传修饰
腺病毒的细胞进入是一个两步过程，包括病毒纤维结头通过 Coxsackievirus 和腺病毒受体（CAR）与细胞结合，以及五边形基底部的 Arg-Gly-Asp 基序（RGD）与细胞整合素的相互作用，导致 Ad5 载体通过 clathrin-coated pits 内化。虽然整合素在不同组织中均匀表达，但 CAR 的表达变化很大，这在很大程度上影响了腺病毒的感染能力。例如，发现来自患者转移的黑素瘤细胞没有 CAR，对 WTAD 感染和细胞杀伤有抵抗力。通过将 RGD 基序整合到纤维结头域的 HI 环或六角蛋白中，实现了对 CAR 表达低的细胞的增强感染。腺病毒 CRAd-Survivin-pk7 使用了一种不同的策略，其中在纤维蛋白（pk7）中加入了一个多赖氨酸修饰（图 3），它具有一个硫酸肝素结合域，结果对肿瘤特异性硫酸肝素蛋白多糖具有高亲和力。
图3. 野生型5型腺病毒基因组的结构以及通过纤维修饰改变天然趋向性（上半部分）和将转基因整合到腺病毒E3区域（下半部分）的概念。受影响的L5区域编码纤维蛋白；上半部分放大显示了带有尾部、杆部和头部结构的纤维单体，以说明所做的修改。将Arg-Gly-Asp基序（RGD）整合到HI环中，可以通过整合素使病毒附着到宿主细胞上，并且通过含有硫酸肝素的受体，在纤维头部通过C末端延伸的赖氨酸残基。下半部分说明了将转基因整合到E3区域的两个概念：(a) 保留大部分E3区域，同时将如人类粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）这样的转基因插入腺病毒载体CG0070中，这里GM-CSF的表达由E3启动子调控。(b) 用例如pCMV-mOX40L表达载体替换E3转录单元在腺病毒载体DNX-2440中，其中小鼠OX40L的表达由巨细胞病毒（CMV）启动子调控。
由于腺病毒的细胞进入受体在哺乳动物的各种组织中普遍表达，确保肿瘤专一性治疗效果的一个策略是通过改变五边形基底部的 RGD 基序来消除天然病毒趋向性，整合突变或缺失到纤维蛋白中，或者通过形成两种不同腺病毒类型的嵌合体。一个非常常用的腺病毒纤维嵌合体是将腺病毒 3 型纤维结头与腺病毒 5 型杆部结合起来，从而识别 CD46 而不是 CAR。
为了引入新的趋向性，Douglas 等人将针对纤维蛋白的抗体片段与叶酸分子化学结合，并获得了靶向腺病毒。叶酸受体在多种恶性细胞表面过度表达。类似地，通过表皮生长因子受体（EGFR），或者通过黑色素瘤相关高分子量抗原等肿瘤标志物的组织特异性靶向已经开发出来，这些是利用二聚体抗体片段（diabodies）的辅助。另一种策略包括用外源蛋白结合域（亲和体）替换大部分纤维蛋白，该亲和体已被特异性筛选，具有对组织或肿瘤标志物的高亲和力结合，例如通过 HER2/neu 而不是 CAR 使细胞附着。
5.3.递送策略
除了将溶瘤病毒局部施用于病变部位外，细胞介导的递送是提高溶瘤腺病毒临床使用的一种新颖且有前景的方法。这里，神经或间充质干细胞在体外被溶瘤腺病毒感染，然后被肿瘤内或系统地递送到患者体内。组织特异性干细胞迁移到其适当的组织壁龛，然后分布病毒，从而掩盖病毒载体对宿主免疫系统的影响，并改善肿瘤内病毒的传播。
6.溶瘤腺病毒的临床试验
腺病毒是临床试验中使用最普遍的溶瘤病毒。在撰写本综述时，我们在 clinicaltrials.org 上使用“oncolytic adenovirus”一词进行了搜索，随后也搜索了文中提到的所有不同腺病毒载体的个别名称，并从 2005 年至今确定了 59 项不同阶段的试验。在这 59 项试验中，17 项已完成，38 项正在进行中。这些试验正在测试 18 种不同的溶瘤腺病毒，通过肿瘤内或静脉注射给药。大多数试验处于 I-II 期，有三项试验处于 III 期，涉及两种溶瘤腺病毒，Oncorine（H101）和 CG0070。表 1-5 提供了网站上收集的临床试验的详细概述。我们将仅在此概述中总结最先进的研究。
6.1.具有特定细胞启动子控制 E1A 的临床载体
Telomelysin（OBP-301）是一种溶瘤腺病毒，其中 hTERT 启动子调控 E1A 和 E1B，它们通过 IRES 元素连接。在对 16 名实体瘤患者的初步 I 期剂量递增研究中，单次肿瘤内注射导致 56.7% 的患者部分反应。仅观察到 1/2 级副作用。目前正在进行针对转移性黑色素瘤（NCT03190824）或食管腺癌（NCT03921021）患者的 II 期试验。使用肿瘤选择性 E2F-1 启动子进行 E1A 转录的首批载体是 Ar6pAE2fE3F 和 Ar6pAE2fF（分别有和没有病毒 E3 区域）。这些载体得到了进一步增强，产生了 CG0070（Ad5-E2F-E1A-E3-GMCSF），在 E3 区域表达 GMCSF，目前正在进行几项临床试验。在于 2018 年发表的 II 期研究中，包括了 45 名未经 BCG 治疗的非肌层浸润性膀胱癌患者。总体反应率为 47%，在 6 个月后，治疗被良好耐受。有趣的是，CIS 可能是对 CG0070 反应最好的病理亚组。CIS 和纯 CIS 患者的六个月完全反应（CR）率分别为 50% 和 58%。在六个月时，没有 CIS 含量肿瘤的患者发展为肌层浸润性疾病。结果是令人鼓舞和有希望的，因为在大约 9.8% 到 40% 的接受膀胱内 BCG 治疗的患者中发生了进展。CG0070 作为单一疗法的 III 期试验已于 2020 年启动（NCT02365818），并且正在进行两项与化疗结合的 I-II 期试验。
6.2.具有 E1A 缺失的临床载体：Ad5-Delta-24
在临床试验中测试的第一个 AdDelta-24 衍生物是 DNX-2401（Delta-24-RGD），主要用于治疗胶质瘤，已经完成了四项 I 期试验（NCT01582516, NCT01956734, NCT02798406, NCT02197169），报告显示长期生存改善和有效的免疫激活证据。25 名患者中有 5 名在治疗后存活超过三年，三名患者肿瘤体积显著减小，无进展生存期为三年。随后进行了六项 I/II 期研究，并确认了安全概况。在进一步的研究中，原始溶瘤构建与其他药物结合使用和/或使用了 AdDelta-24 的进一步开发。DNX-2401 与 pembrolizumab（一种抗 PD-1 抗体）联合的 II 期试验包括了 49 名复发性胶质母细胞瘤患者（NCT02798406）。中位总生存期为 12.5 个月，18 个月生存率为 20.2%，与单独使用 iomustine 和 temozolomide 的中位总生存期 7.2 个月相比，溶瘤腺病毒的结果令人鼓舞。
表 1-5 列出了从 2005 年到 2021 年 8 月在 clinicaltrials.org 上搜索到的溶瘤腺病毒的临床试验。从 2005 年至今共进行了 59 项试验。其中 17 项已完成，38 项正在进行中。这些试验正在测试 18 种不同的溶瘤腺病毒。表 1-4 根据图 1 中解释的条件复制腺病毒的概念对临床试验进行了分组，而表 5 列出了 enadenotuvirev（Colo-Ad1）的临床试验。
6.3.具有特定细胞启动子控制 E1A-Delta-24 的临床载体
ICOVIR-5（Ad5-E2F-Delta-24-RGD）在黑色素瘤患者的 I 期临床试验（NCT01864759）中通过静脉系统给药，并且被良好耐受。尽管在总共 12 名患者中没有观察到肿瘤缩小，但在四名患者的转移性皮肤或肝脏病变中检测到病毒 DNA，表明 ICOVIR-5 可以在静脉给药时靶向并检测转移性肿瘤细胞。
VCN-01（Ad5-E2F-Delta-24-RGD-PH20）表达透明质酸酶（PH20），这增强了病毒在肿瘤内的传播。目前，它正在与化疗或免疫检查点抑制剂结合使用，正在进行多项临床试验，用于晚期胰腺癌（NCT02045589 和 NCT02045602）和头颈部鳞状细胞癌（NCT03799744）。在一项视网膜母细胞瘤的试验（NCT03284268）中，VCN-01 的给药被良好耐受，并在视网膜母细胞瘤玻璃体种子中表现出抗肿瘤活性。
6.4.具有 E1B55K 缺失的临床载体
ONYX-015（dl1520）是第一个用于治疗头颈癌的溶瘤腺病毒的临床试验。尽管没有观察到客观反应，但在 22 名患者中有 5 名在注射部位检测到肿瘤坏死。2000 年在中国启动了 Oncorine（H101）的 I 期临床试验。除了可接受的安全性概况外，15 名患者中有 3 名报告了显著的肿瘤缩小。III 期试验表明，Oncorine 在与化疗结合治疗头颈部鳞状细胞癌（SCCHN）的患者中实现了更好的阳性反应率（79%），而不是单独使用化疗（40%）。基于这项研究，它在 2005 年被中国国家食品药品监督管理局（SDFA）批准为世界上第一个商业化的溶瘤病毒，用于与化疗结合治疗 SCCHN。
6.5.基于直接进化的临床载体
一种新型腺病毒载体 enadenotucirev（Colo-Ad1）是通过有向进化从 B 至 F 物种的不同血清型池中衍生而来，并被选择仅在结肠癌细胞中复制。进行了三项 I 期试验。其中一项包括 17 名实体瘤患者，比较了肿瘤内与静脉应用的疗效。在 12 名患者中的 11 名通过静脉输注后在肿瘤样本中检测到病毒 DNA，在 5 名患者中的 2 名通过肿瘤内注射后检测到。两种方法都被良好耐受，没有报告与治疗相关的严重不良事件。目前正在进行两项 enadenotucirev 的 I 期试验，招募结肠癌、头颈癌或其他上皮肿瘤的患者，以 enadenotucirev 和 nivolumab（PD-1 抑制剂）结合治疗（NCT02636036），或招募直肠癌患者（NCT03916510）与放疗和化疗（卡培他滨）结合治疗。为了进一步激发针对肿瘤的免疫反应，目前正在对 enadenotucirev 的两种变体进行 I 期临床试验：NG-350A（NCT03852511），它表达 CD40 抗体，NG-641（NCT04053283），它表达双特异性 T 细胞引导剂（BiTE）FAP/CD3 趋化因子配体 9 和 10（CXCL9 和 CXCL10）和干扰素 alpha（IFNα）。
7.结论和未来展望
基于溶瘤腺病毒的治疗的临床应用已经证明了它们的巨大潜力，但仍然处于起步阶段。特别是，与已经建立的疗法（不增加毒性）的广泛兼容性、多种细胞杀伤效应以及诱导免疫原性细胞死亡使其在临床领域非常吸引人。在生成新型病毒载体方面，有三个方面至关重要：（a）组织特异性，（b）复制和裂解能力；以及（c）触发免疫系统，以实现系统治疗反应。有几种复杂的方法可以提高肿瘤细胞感染的选择性，以获得更高水平的安全性和有效性——例如，通过添加特定的转基因。然而，选择性复制的溶瘤腺病毒通常在复制能力上比野生型减弱。这不仅影响肿瘤的裂解，还影响免疫系统的激活。与小分子的组合，与信号通路相互作用，如 JAK/STAT 通路、放射或化疗，是解决这个问题的可能策略。新腺病毒载体开发中最有希望的方面是病毒通过免疫系统激活，这将代表一种针对肿瘤的疫苗策略。更好地理解引入特定转基因或将它们与免疫检查点抑制剂结合的相互支持效应，将允许在治疗策略中采取新的方向，以增加溶瘤或免疫刺激性功效。目前正在进行几项临床试验，哪些策略和修改将提供最佳结果将逐渐变得清晰。在这些试验中一个重要方面将是彻底的患者分层，解决所使用的溶瘤腺病毒的特征。由于我们刚刚开始将主要在实验室中获得的知识转化为临床应用，新的发现将自动在开发新的癌症治疗策略方面产生巨大的兴趣，这些策略具有巨大的多样性，使用腺病毒进行治疗。
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