响应面法优化灵芝多糖提取工艺及其抗氧化活性

百科 2024-12-19 22:01 湖北

颜瑞辰 ¹洪允炬 ^1,²李悦 ^1,²李长田 ^3,⁴陈春宇 ⁵张影 ¹华霜 ¹

1. 吉林农业科技学院中药学院，吉林 132109；2. 中国科学院天津工业生物技术研究所，天津 300308；3. 食药用菌教育部工程研究中心，长春 130118；4. 吉林农业大学植物保护学院，长春 130118；5. 重庆三峡医药高等专科学校药学院，重庆 404120

摘要为提高灵芝Ganoderma lingzhi多糖的提取率，利用响应面分析法优化灵芝多糖提取工艺。分别考察灵芝多糖提取方法、提取时间、料液比、提取次数对多糖得率的影响。结果表明，采用回流提取方式多糖得率最高，该方式下最佳条件为提取温度85 ℃，提取时间4.2 h，料液比例1∶31，提取2次，提取率为1.676%。灵芝子实体多糖体外抗氧化活性结果表明，灵芝子实体多糖在1 mg/mL质量浓度下对1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基与羟自由基清除率分别为94.23%和61.21%。研究结果为灵芝多糖的提取及资源开发利用提供参考。

关键词灵芝；回流提取法；响应面法；多糖；抗氧化活性

灵芝Ganoderma lingzhi药用历史悠久，具有补气安神、止咳平喘等功效。《神农本草经》将灵芝列为“上品”，称其久服后“轻身不老，延年神仙”，可见灵芝具有较高的药用价值。灵芝含有多糖类、三萜、蛋白质、生物碱和麦角甾醇等多种活性成分，可起到保护心脏、保肝、抗炎镇痛、抗氧化等作用，对于改善心悸、疲劳乏力、高血压等症状均有显著疗效，是用于滋补身体、调节免疫、补气安神的中药。

灵芝多糖具有抗肿瘤、调节免疫力、抗菌、降低血糖和血脂等多种功效。常用的灵芝多糖提取方法有热水浸提法、回流提取法、超声波辅助提取法、酶提法等。其中热水浸提法对水温要求较高，花费时间较长，多糖提取不完全；回流提取法虽耗时但可提高提取效率，且操作简单，更加安全；超声波提取法与酶提法作为新式提取方法，提取效率较高，但长时间超声会对成分造成破坏；酶提法专一性强、成本高，不宜广泛使用。在灵芝多糖提取中，提取时长、料液比、提取温度和提取次数等均会对多糖得率产生影响，需通过大量试验确定各因素的最优条件。传统分析多采用正交分析法，但试验组多，操作繁琐。响应面法（RSM）作为新式分析方法，可将数理统计与数学模型相结合，通过相对较少的试验数量建立模型，获得更精确的试验结果，具有经济、便捷、高效的特点。本试验采用Box-Behnken设计的响应面法优化灵芝多糖的提取工艺，并对其抗氧化活性进行考察，为灵芝多糖的资源开发与利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验仪器和材料

1.1.1 试验仪器

UV-2550型双光束紫外分光光度计（日本岛津公司），XPR-204型电子分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司），STO-TC型自动样品制备系统（北京本立科技有限公司），KQ-500DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司），KDM型可调控温电热套（天津鑫博得仪器有限公司），HH-4型电热恒温水浴锅（北京科伟永兴仪器有限公司）。

1.1.2 试验材料

灵芝子实体（吉林省吉林市左家镇特产研究所提供），D-无水葡萄糖和水杨酸（中国食品药品检定研究院），蒽酮、硫酸和无水乙醇（国药集团化学试剂有限公司），1，1-二苯基-2-三硝基苯肼无水乙醇溶液（DPPH，福州飞净生物科技有限公司），灵芝子实体多糖（西安瑞迪生物科技有限公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 标准曲线绘制

称取12 mg D-无水葡萄糖作为对照，将其定容至100 mL的容量瓶中，充分混匀后置于4 ℃备用。量取上述对照品溶液0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.5 mL分别置于10 mL比色管中，纯化水定容至2 mL，快速加入硫酸蒽酮溶液6 mL，摇晃均匀，放置15 min后，冰浴15 min，在625 nm的波长下测量吸光度值，以 D-无水葡萄糖质量浓度（ρ）为横轴，吸光度（A）为纵轴，绘制标准曲线，并求出回归方程。

1.2.2 灵芝多糖提取方法的确定

参考文献［10-11］研究方法，将灵芝子实体烘干、粉碎，过2号筛（850 μm），得到灵芝子实体样品粉末。称取1.0 g样品粉末，以料液比1∶20（g∶mL）分别置于回流装置（2 h）、超声波提取器（60 ℃，2 h和30 min）、恒温水浴锅（90 ℃，2 h）中考察回流提取法、超声波辅助提取法和热水浸提法3种常用提取方法对灵芝子实体多糖的提取率影响，并根据多糖提取率选择最佳提取方法。

1.2.3 灵芝多糖含量测定方法建立

称取1.0 g样品粉末，置于三角瓶中，加纯化水充分浸透，在一定的时间（A）、料液比（B）、提取次数（C）下进行回流。温度达到85 ℃过滤，热水洗涤滤器滤渣，合并滤液，蒸干，残渣加入10 mL水，缓慢加入90 mL无水乙醇，摇匀后4 ℃静置，于离心机中（4 000 r/min）离心10 min，除去上清液，沉淀物用热水定容于25 mL比色管中，冷却后加入纯化水至刻度，摇匀。再取上述溶液5 mL定容至50 mL，得到供试品溶液。

取2 mL上述供试品溶液，按照“1.2.1”中相同显色法测定吸光度，根据标准曲线计算所测物质的质量浓度和提取率。多糖提取率的公式为Y=（ρ×n）/［m×2×（1-w）×1000］×100，式中Y表示多糖提取率（%），ρ表示多糖的质量浓度（mg/mL），n表示稀释倍数，m表示取样量（g），w为样品中水的质量。

1.2.4 单因素试验设计

参考文献［12-15］的提取方法，在灵芝多糖的提取过程中，对其有较显著影响的因素包括提取时间、提取温度、料液比和提取次数等。试验以回流法提取，水为溶剂，研究时间、料液比和提取次数三因素对灵芝多糖提取率的影响。

提取时间：按“1.2.3”方法，称取1.0 g样品粉末，加入20 mL水作提取溶剂，分别在回流装置上提取2，3，4，5，6 h，通过计算提取率，研究不同提取时间对灵芝多糖提取率的影响。

料液比：按“1.2.3”方法，称取1.0 g样品粉末，以10，20，30，40，50 mL的水作为回流溶剂，于回流装置上回流4 h，计算提取率，研究不同的料液比例对灵芝子实体多糖提取率的影响。

提取次数：按“1.2.3”方法，称取1.0 g样品粉末，加入30 mL水作为提取剂，回流提取4 h。分别进行1，2，3，4次数的提取，考察提取次数与多糖提取率的关系。

1.2.5 响应面试验设计

根据单因素试验结果，以提取时间（A）、料液比（B）、提取次数（C）3个因素考察多糖提取率，并以其为响应值，采用Design-Expert 12软件进行分析，因素水平见表1^［16］。

1.2.6 灵芝多糖的纯化

试验获得灵芝粗多糖，除去蛋白质（Sevage法）纯化后，加入5倍体积分数为95%的乙醇，置于冰箱过夜，过滤^［12］。干燥后获得粉末状灵芝多糖。

1.2.7 DPPH自由基清除率测定

参照文献［12，17］的方法，将2 mL不同质量浓度的多糖溶液加入试管中，再加入2 mL 0.2 mmol/L的DPPH，混合后在室温下暗处反应30 min，在517 nm波长处测定吸光度（A_i）。取上述2 mL多糖溶液，加入2 mL无水乙醇，反应30 min，测定吸光度（A_j）；取2 mL DPPH溶液，加入2 mL无水乙醇，反应30 min测定吸光度（A₀）。每个样品测定3次，取平均值，以维生素C的吸光度作阳性对照，计算清除效果。DPPH自由基清除率（%）=［（A₀-A_i+A_j）/A₀］×100。

1.2.8 羟自由基清除率测定

取不同质量浓度的灵芝多糖溶液1 mL，分别加入2 mL 1.8 mmol/L FeSO₄溶液，1.5 mL 1.8 mmol/L水杨酸溶液和0.1 mL体积分数为0.03%的H₂O₂溶液。摇匀后，在37 ℃恒温水浴锅反应30 min，测定510 nm处吸光度（A_i）。将FeSO₄溶液更换为等量的去离子水，测量吸光度（A_j）。将多糖溶液用等量去离子水取代，测量吸光度（A₀）。用维生素C的吸光度作阳性对照，计算清除效果^［18-19］。羟自由基清除率（%）=［（A₀-A_i+A_j）/A₀］×100。

2 结果与分析

2.1 灵芝多糖最佳提取方法

筛选不同提取方法下灵芝多糖的提取率如图1所示。在回流提取法中，提取温度设定85 ℃，多糖提取率为0.697%，为3种方法中提取率相对最高。超声波辅助提取法2组试验中，30和120 min条件下提取率分别为0.368%和0.369%，二者相近，可能是超声时间延长，样品受到超声波剪切力的时间也随之增长，从而导致多糖被破坏，影响灵芝多糖的提取率。热水浸提法的多糖提取率为0.477%，低于回流提取法的多糖提取率。综合分析，选择回流提取法为灵芝子实体多糖的最佳提取方法。

图1 不同提取方法灵芝多糖提取率Fig. 1 Extraction rate of G. lingzhi polysaccharides obtained under the different extraction methods

2.2 标准曲线绘制

取不同量对照品溶液进行硫酸蒽酮显色反应，于625 nm测吸光度值。以测得的吸光度为纵轴，质量浓度为横轴，绘制对照品标准曲线（图2）。D-无水葡萄糖为对照的回归方程为y=5.031x-0.004 1（R² = 0.999 4）。

图2 葡萄糖标准曲线Fig. 2 Standard curve of glucose

2.3 单因素试验结果

2.3.1 提取时间优化结果

对多糖得率影响的多种因素中，提取时间影响较为显著。提取时间对灵芝多糖提取率的影响如图3所示。设定提取时间为2~6 h，随着提取时间增加，多糖提取率先增加后减少，在4 h时达到最高点。当提取时间超过4 h后，长时间的高温回流导致多糖分解，进而提取率降低，较短时间内多糖无法提取完全，提取率不高。因此选择最高值附近的3，4，5 h参与响应面优化。

图3 提取时间对灵芝多糖提取率的影响Fig. 3 Effect of extraction time on the extraction rate of G. lingzhi polysaccharides

2.3.2 料液比优化结果

料液比对灵芝多糖提取率的影响如图4所示。料液比为1∶10至1∶50，多糖提取率随料液比增大而先增加后降低，在1∶30时出现峰值。这可能是溶剂量过少无法完全提取多糖。溶剂量过大会加剧杂质溶出，影响多糖提取率。因此以最高值附近的1∶20，1∶30，1∶40参与响应面优化。

图4 料液比对灵芝多糖提取率的影响Fig. 4 Effect of solid-liquid ratio on the extraction rate of G. lingzhi polysaccharides

2.3.3 提取次数优化结果

提取次数对灵芝多糖提取率的影响如图5所示。灵芝多糖的提取率随提取次数的增加而增大，但2次后增长缓慢。分析为随着回流次数的增加，杂质溶出的量也相应增加，影响多糖的提取率，综合考虑成本、效率、操作、环保等因素，选择1，2，3次回流次数参与响应面优化。

图5 提取次数对灵芝多糖提取率的影响Fig. 5 Effect of number of extraction times on the extraction rate of G. lingzhi polysaccharides

2.4 响应面法优化灵芝多糖提取工艺

2.4.1 响应面试验方案与结果

根据Box-Betaken设计试验，考察灵芝子实体多糖提取率，试验结果为3次平行试验均值（表2）。

表2 响应面试验方案与结果Table 2 Design and results of response surface experiment ( n=3 )

2.4.2 方差分析

采用Design-Expert 12软件进行分析，得到二次多元回归方程为：Y=1.63+0.044 7A+0.013 9B+0.124 9C-0.020 5AB+0.002 5AC+0.022 3BC-0.123 2A²-0.102 9B²-0.151 4C²。

模型中P_模型<0.000 1，说明该回归模型具有极显著的相关性；P_失拟项=0.134 6>0.05（表3），表明该方法可行。用相关系数（R）对该方法进行适用性分析。由F值可见，3个因素对灵芝多糖提取率的影响顺序为：C>A>B。其中，提取时间（A）和提取次数（C）对灵芝多糖提取率影响极显著（P<0.01）。

二次多元回归方程相关系数平方R²=0.988 3，可见回归方程高度显著，证明利用响应面法分析灵芝多糖提取工艺可行。

2.4.3 响应面试验结果分析

响应面模型的等高线越密集、斜率越大，因素与因素间的相互影响越明显^［20-21］。各因素交互作用对灵芝多糖提取率的影响如图6所示。在一定的提取次数下，随着时间的延长，多糖的提取率逐渐提高，4 h时达最高，随后稍有下降。当提取次数固定，时间为2 h时，随着料液比增加，灵芝多糖的提取率也随之提高，1∶30为最高值，随后降低。当料液比固定时，多糖提取率随提取次数的增加而显著提升，当提取次数为1时，提取率在4 h达到最大，随后降低。提取时间与提取次数响应面图中的等高线最密集、坡度最大，表明提取时间与提取次数2因素交互作用最显著，其次是提取时间与料液比2因素交互。表明各因素交互作用的次序依次为提取时间与提取次数、料液比与提取次数、提取时间与料液比，与表3分析结果一致。

图6 各因素交互作用对灵芝多糖提取率的影响Fig. 6 Effect of interaction of various factors on the yield of G. lingzhi polysaccharides

表3 方差分析表Table 3 ANOVA (Analysis of Variance) table

注：*表示影响显著（P<0.05），**表示影响极显著（P<0.01）

Note：* indicates significant(P<0.05), ** indicates extremely significant(P<0.01)

2.4.4 最佳提取工艺的确定

依据响应面模型得出的各因素交互条件，得到最优工艺为提取时间4.174 h，料液比1∶31.274，提取2.288次，模型预测提取率可达1.657%。基于现实操作情况，为方便计时与取量，提取时间与料液比分别取4.2 h与1∶31。考虑时间等因素，提取次数确定为2次。最佳提取工艺结果：提取时间4.2 h，料液比1∶31，提取2次。

2.4.5 试验验证

采用“2.4.4”中确定的提取工艺，称取样品1.0 g，按照“1.2.3”下方法进行平行试验，设立3组。结果显示，该工艺下的灵芝多糖的平均得率为1.676%，与模型的预测值相差0.019%，表明该模型有效。

2.5 方法学考察

2.5.1 精密度考察

量取“1.2.1”下对照品溶液2 mL，采用相同显色方法，在625 nm波长下，对样品进行6次连续测定吸光度值，RSD为0.16%，结果显示样品的精密度符合标准。

2.5.2 重复性考察

将同一批次的6份样品按“1.2.3”下方法制备，用同样的显色法在625 nm条件下按照“1.2.1”流程测定吸光度，RSD为1.415%，结果显示其重现性良好。

2.5.3 加样回收率考察

取已知含量的样品9份，分别加入对照品低、中、高3个水平适量，按照“1.2.1”相同方法显色并测定吸光度，计算样品加样回收率，结果见表4。低、中、高的平均回收率分别为97.46%，100.34%，100.91%，RSD均<5%，表明该方法加样回收率良好。

表4 加样回收率Table 4 Sample recovery

2.6 灵芝多糖体外抗氧化活性

2.6.1 DPPH自由基清除率

灵芝子实体多糖对DPPH自由基清除效果如图7所示，样品对DPPH清除效果与其质量浓度正相关。当多糖质量浓度为0.2~0.4 mg/mL时，DPPH自由基清除能力显著增强。当多糖质量浓度达到0.4 mg/mL以上时，其清除率超过90%，可清除大部分DPPH自由基。维生素C与多糖质量浓度均为1 mg/mL时，二者清除率接近，分别为94.68%与94.23%。由此可见，灵芝子实体多糖具有较好的体外抗氧化活性。

图7 灵芝子实体多糖对DPPH自由基清除效果Fig. 7 Effect of G. lingzhi fruit body polysaccharides on the clearance rate of DPPH free radical

2.6.2 羟自由基清除率

当多糖质量浓度增加时，对羟基的清除率随之增加。在质量浓度为0.2~0.6 mg/mL时，清除率显著提升，在超过0.6 mg/mL后，对照维生素C的清除率达到99%以上，灵芝多糖清除率约为60%。当质量浓度为1 mg/mL时，维生素C与多糖清除率分别为99.68%和61.21%（图8）。

图8 灵芝子实体多糖对羟自由基清除效果Fig. 8 Effect of G. lingzhi fruit body polysaccharides on the clearance rate of hydroxyl radical

3 讨论

灵芝的药用历史悠久，现代研究发现，灵芝多糖具有免疫调节、抗炎、抗氧化、抗肿瘤等药理作用，是灵芝的主要活性成分之一。近年来灵芝多糖提取方法有水提法、超声提取法、微波提取法、复合酶法等。孙小梅以水浴回流法，料液比1∶20，100 ℃，6 h所得提取率为0.671%。田淑雨等以响应面法优化超声波法提取工艺：料液比1∶25，提取功率760 W，超声时间60 min，多糖得率达到3.6%。谢苗等通过对5种低共熔溶剂筛选，确定以氯化胆碱-尿素含量34%，提取时间1.9 h，醇沉7.3 h，多糖得率达到1.1%。本研究通过响应面法，确定以回流提取法提取灵芝多糖的最优工艺：提取时间4.2 h，料液比1∶31，提取次数2次，该工艺条件下的灵芝多糖提取率为1.676％。该提取条件较以往回流提取工艺具有提取次数少，能耗低，提取总时长少的优点，经计算灵芝多糖提取率提高1.3倍。利用响应面法对灵芝多糖的最佳提取工艺进行优化切实可行，为灵芝多糖提取提供参考。

自由基产生于细胞代谢过程中，会诱导氧化反应，引起细胞功能和结构改变，过量的自由基会引发一系列慢性疾病。本研究通过对灵芝多糖抗氧化试验发现，灵芝多糖溶液质量浓度越大，其对DPPH自由基和羟自由基清除效果越好。当多糖质量浓度为1 mg/mL时，其对DPPH自由基清除能力与维生素C相近，可达到94.23%，同时羟自由基清除率达到61.21%，可清除大部分自由基。赵艺方等纯化的黔产黑灵芝多糖，对DPPH自由基、ABTS阳离子自由基、羟自由基清除率的IC₅₀值分别为4.22，3.11，3.97 mg/mL。吴扬洋等进行龙泉灵芝多糖抗氧化试验，结果表明其对DPPH自由基与羟自由基清除率的EC₅₀分别为1.08，1.16 mg/mL。综合分析，灵芝多糖具有较好的抗氧化活性，具备良好的应用前景。

本研究优化了回流提取法下灵芝多糖提取工艺，并考察了灵芝多糖体外抗氧化活性，为灵芝多糖的资源开发利用提供了依据。

引用本文：颜瑞辰，洪允炬，李悦，等.响应面法优化灵芝多糖提取工艺及其抗氧化活性［J］.菌物研究，2024，22（4）：378-386.

作者简介：颜瑞辰，男，研究方向：中药资源开发。

通讯作者：华霜，E-mail：huashuang888@jlnku.edu.cn

基金信息：吉林省教育厅项目（JJKH20220395KJ），吉林农业科技学院博士人才基金项目（111022022020），三峡库区道地药材开发利用重庆市重点实验室项目（Sys20210014），天津市合成生物技术创新能力提升行动项目（TSBICIP-CXRC-006）

来源：菌物研究

精彩推荐

易菇网

易菇网官方网站公众微信平台，发布食用菌行业资讯，普及食用菌技术，促进食用菌行业交流。