黄芩⁃黄连药对及其活性成分治疗糖尿病肾病的作用机制研究进展

1.1 针对湿热病机的理论依据

湿热是DM及其进展疾病DN的病机关键。《黄帝内经》中指出“肥者令人内热”可转为消渴、“热则消肌肤，故为消瘅”“胃中热则消谷”“热中善饥”等病因病机。《金匮要略》中指出“胃中有热，即消谷引食”，治疗也重视清泄胃热，如葛根芩连汤等。《外台秘要》转载《古今录验》中15首治疗消渴的方剂，多以黄连为主药。《圣济总录》消渴诸方中寒性药使用占比达51.94%，寒性药中又以清热泻火（50%）和清热燥湿药（27%）占比最多，黄连和黄芩使用率分别为27.47%和13.73%。《三消论》这部书的观点为消渴乃燥热怫郁所致，用药多以辛苦寒配伍。仝小林院士提出“脾虚胃热是‘消瘅’的核心病机”。随着社会的发展，诊疗手段的进步，糖尿病及其所致并发症多于体检等情况下偶然发现，故多处于疾病早期即脾瘅阶段，患者体型尚未消瘦而多肥胖或超重，气阴尚未大虚而以实热、痰瘀等邪实为主，即为“脾瘅肾病”。赵进喜等认为郁、湿、痰、瘀皆可致热，热为壮火，壮火食气，概括指出内热为DN的始动因素。国医大师吕仁和点明DN乃肾络形成了“微型癥瘕”，在此过程中，脾肾运化和主水功能失常，聚为湿患，日久则酿为湿热，治疗中常活血与清热并用，常用丹参、赤芍、黄连、黄芩等药物。王耀献教授提出湿热易犯肾脏，内热证是DN最常见的证型，其中尤以湿热型最多，建议予葛根黄芩黄连汤及以本方随证化裁治疗。临床常用于DN治疗的黄葵胶囊也是立足于湿热病机研制的。随着经济发展，饮食肥甘厚味增加，肥甘则滋腻成湿，味厚则内蕴为热。脾喜燥恶湿，胃喜润恶燥，湿热相搏，则脾弱胃强，乃见多食善饥而体胖痰多等症。湿热纠缠，稽留于肾，肾失所主，闭藏失职，精微渗漏，水湿泛滥，则见尿糖、尿蛋白，下肢、胸腹乃至全身水肿。故湿热内蕴为DN的基本病机，湿热戕害气血阴阳，方变生他证。芩连药对相须为用，正中DN湿热病机。

1.2 基于药性功效的配伍依据

药性功效是中药发挥临床疗效的基础，因此需要归纳总结药物性味归经、升降毒性等属性。黄芩性寒，味微苦，无毒，主入肺、胃、大肠经，可清痰热、清胃中热、治热毒骨蒸、治消谷、疗疔疮火疡等。黄连性寒，味苦，无毒，主入肝胆、心及心包、脾胃、大肠经，可治热气、祛热毒、止消渴，清脾胃湿热以厚肠，平肝胆火热以疗目疾。历代医家不乏运用芩连药对者。例如《伤寒论》中表邪未解、热陷阳明证，治用葛根芩连汤，以该药对清解胃肠热毒；治疗少阴热化、心烦口渴失眠之证的黄连阿胶汤，以该药对清热护阴。《外台秘要》中的黄连解毒汤，以芩连药对合黄柏、栀子以清三焦火毒，可知黄芩、黄连清热之功显著。《外台秘要》中的消渴麦冬丸运用黄芩、黄连合黄柏、苦参等药专疗消渴。《医方类聚》中黄连使用131次，黄芩使用52次，均属消渴高频用药。《太平圣惠方》中治“消渴烦躁”诸方，如黄连散、麦门冬散，亦多用芩连药对。祝谌予先生对于尿酮阳性，常用芩连药对、茯苓等以泻浊毒。黄芩、黄连和黄柏亦为颜乾麟治疗消渴的常用药对。刘玉宁提出DN的肾络三态理论，其中早期宜用以黄芩、黄连清热配葛根透散之葛根芩连汤。可知，黄芩、黄连治疗消渴及DN由来已久。

1.3 药对配伍后药效优化的研究

药对是在中医理论的指导和临床疗效的基础上所创制，欲阐明经典药对的科学内涵并惠及更多患者，还需要深入分析其活性成分与药效机制。对芩连药对共煎自沉淀进行定性分析的研究中，鉴定出的化合物包括小檗碱、黄芩苷、黄芩素、芹菜素-7-O-葡萄糖醛酸苷、表小檗碱、汉黄芩苷、黄连碱、巴马汀、千层纸素A、汉黄芩素等，其中以黄芩苷和小檗碱含量最高，分别为(41.86±0.26)%和(25.44±0.14)%。采用高效液相色谱对黄芩、黄连的提取物进行分析，结果显示不同温度、时间条件下两药单煎时，大多数含量较少的化合物的浓度是成对提取时的1.09～44.13倍，而主要成分黄芩苷、汉黄芩苷、黄连碱和小檗碱等的浓度明显降低，仅约为共煎时的0.024～0.764倍，说明黄芩、黄连共煎可增加主要活性成分的含量，配伍共煎可能使得药物等效剂量降低。在采用大鼠进行药代动力学的研究中发现，与物理混合相比，黄芩、黄连共煎组的t_1/2、T_max较于单煎组明显延长，说明二药合煎可使有效成分释放更加平稳和持久。研究证明，黄芩、黄连或二药联合提取物均可改善2型糖尿病（T2DM）大鼠的糖脂代谢，这与调节糖代谢关键酶、抑制炎症水平等机制相关，且联合提取比单药效果更显著。总之，药对配伍后活性成分含量、药代动力学改变，降糖、降脂、抗炎等作用增强。

DN发病的基础是糖脂代谢紊乱，并由肾脏细胞凋亡、肾脏的炎症和纤维化、肠道微生物改变及黏膜屏障功能受损、遗传易感性和长期表观遗传修饰等分子机制相互交织、互相促进发展而来。

2.1 调节糖脂代谢紊乱

高糖引起的肾小球血管不均衡扩张导致了肾小球高灌注、高滤过、高血压，血浆流量升高带来的机械力损伤毛细血管内皮细胞，血液滤过屏障损伤，导致滤过的白蛋白增加。血脂异常刺激间质细胞增殖和基底膜增生，血管阻力升高，与肾功能异常密切相关。研究证明，降低血糖可产生“代谢记忆”或“遗留效应”，使DM并发为DN的风险降低。降脂药物对于血脂正常的DN患者仍具有保护血管功能的作用。芩连药对（10.20 g/kg、5.10 g/kg）降糖效果显著。芩连药对（2.5 g/kg、5 g/kg、10 g/kg）通过加快脂质代谢速度，抑制脂质合成，调节血脂水平。芩连药对联合提取物（6.3 g/kg、12.6 g/kg）可降低空腹血糖、空腹胰岛素、三酰甘油、总胆固醇、低密度脂蛋白水平，并升高高密度脂蛋白水平，且比单药效果显著。小檗碱通过改善胰岛素抵抗、修复胰岛细胞损伤降低血糖，通过调节肝脏低密度脂蛋白受体的表达调节血脂。小檗碱（300 mg/kg）通过减轻线粒体形态改变、肾小管脂肪酸氧化，从而减轻脂质沉积和肾小管损伤。黄芩苷（150 mg/kg）可显著降低血糖、血脂。

2.2 减少肾脏细胞凋亡

肾固有细胞的凋亡是DN发生发展的典型特征。凋亡是细胞程序性死亡的方式之一，DN足细胞凋亡发生先于足细胞耗竭、尿白蛋白排泄以及系膜基质扩张，属于疾病早期的病理机制。发动相关蛋白1（Drp1）与其位于线粒体的外膜上的受体结合，形成寡聚体诱导线粒体裂解并释放凋亡相关蛋白，导致足细胞凋亡。小檗碱（0.4 μmol/L）可抑制棕榈酸诱导的条件性永生化小鼠足细胞Drp1活化，稳定线粒体形态，缓解细胞凋亡。腺苷单磷酸活化蛋白激酶（AMPK）在肾脏中主要表达于足细胞和肾皮质小管上皮细胞，AMPK对于维持腺苷三磷酸酶（ATP）以保证肾细胞代谢至关重要，DN中AMPK水平普遍降低，哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）可抑制AMPK的活性。小檗碱通过增强 AMPK活性，抑制mTOR活化，改善自噬障碍，减少足细胞损伤和凋亡，从而减轻肾脏损伤。核因子-红系2相关因子2（Nrf2）和抗氧化反应元件（ARE）结合，启动抗氧化基因表达，促进抗氧化调节细胞凋亡。黄芩苷通过增强Nrf2-ARE信号通路表达，增强抗氧化作用，减轻肾小管上皮细胞凋亡。

2.3 缓解炎症和纤维化

炎症和纤维化是DN进展的关键因素。Toll样受体（TLRs）属于模式识别受体，主要功能是识别损伤或病原信号而激活免疫系统，激发炎症级联反应。核转录因子-κB（NF-κB）是免疫反应中关键的诱导型调节因子，NF-κB被激活可诱发多种黏附分子、炎症因子和趋化因子的分泌，例如白细胞介素-6（IL-6）、白细胞介素-1β（IL-1β）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）等。在研究芩连煎剂对T2DM模型SD大鼠的作用中发现，芩连药对（10.2 g/kg、5.1 g/kg）抑制肝脏TLR4的表达，降低肝脏IL-6、IL-1β、TNF-α、NF-κB含量，推测芩连药对可能通过下调TLR4/NF-κB通路来缓解DM患者的慢性炎症。p38丝裂原活化蛋白激酶（p38 MAPK）通路活化增强可加剧DN的炎症和纤维化。芩连药对及黄芩、黄连单药组均可减轻肝脏脂肪变性、胰岛细胞萎缩、骨骼肌炎症浸润以及脂肪组织细胞增大。抑制促炎因子C反应蛋白（CRP）、IL-1β、抵抗素、TNF-α、IL-6、一氧化氮的表达。降低血清中MAPK通路上c-jun氨基末端激酶、细胞外调节蛋白激酶等的mRNA的表达。二药联合组比单药组效果更显著。上皮-间质转化（EMT）驱动了成纤维细胞分化为肌成纤维细胞，并诱导外泌体和细胞因子分泌，促进炎症和纤维化。转化生长因子-β（TGF-β）是EMT的诱导因子之一。泻心汤（300 g/kg、600 g/kg，包含等比例黄芩、黄连、大黄）可降低糖脂水平、减轻系膜基质扩张和肾小球系膜增厚，抑制TGF-β1/Smad蛋白（Smad）信号通路，并通过降低I型胶原蛋白（Col-I）、Ⅳ型胶原蛋白（Col-Ⅳ）、IL-1β、TNF-α等分子的表达，改善db/db小鼠肾脏的纤维化和炎症。泻心汤（4 mg/L、8 mg/L、16 mg/L）可降低高糖诱导的肾系膜细胞的α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、TGF-β、Col-I、NF-κB的表达。泻心汤（4 mg/L）及其单药均可降低大鼠肾小球系膜细胞增殖，降低单核细胞趋化因子-1（MCP-1）和Col-Ⅳ的表达，改善糖脂代谢紊乱和肾功能损伤，并且抑制TGF-β1、NF-κB p65表达，且联合运用比单药效果显著。黄连解毒汤（10 g/kg）合六味地黄丸可能通过降低血清IL-17、血管内皮生长因子（VEGF）、TNF-α、CRP水平，降低血肌酐、尿素氮、尿蛋白以及减轻肾病理损伤。对比前列地尔单用，联合黄连解毒汤（含黄连15 g、黄柏 12 g）能更显著地降低DN患者血浆TNF-α、IL-6、超敏C反应蛋白（hs-CRP）等指标，推测该方通过降低机体炎症水平，提高肾功能改善程度。小檗碱可通过影响TLR4/NF-κB通路的活性减轻db/db小鼠的肠道炎症，也可通过抑制该通路减轻高糖诱导的足细胞炎症反应和凋亡，从而改善肾功能。Tribbles homolog 1（Trib1）是M2型巨噬细胞分化中重要的调节蛋白。小檗碱联合二甲双胍通过增强Trib1的表达，调节巨噬细胞极化，下调NF-κB等因子的表达调节炎症反应，从而延缓DN进展。黄芩苷（40 g/L）具有显著的抗炎活性，可抑制巨噬细胞、T淋巴细胞、中性粒细胞等炎症细胞的浸润，抑制炎症因子的表达，还具有抗氧化作用，可显著激活Nrf2信号，增加下游抗氧化酶的表达。小檗碱（10 μmol/L、30 μmol/L、90 μmol/L）通过抑制脂多糖（LPS）诱导的大鼠系膜细胞增殖，从而抑制NF-κB抑制蛋白（i-κB）的分解和NF-κB的核移位，并减少纤维连接蛋白的表达，说明小檗碱减轻肾脏纤维化是独立于其降糖功效的。抑制磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/丝氨酸-苏氨酸激酶（Akt）的激活可通过改变巨噬细胞极化调节炎症和代谢状态。黄芩苷通过抑制PI3K /Akt/mTOR通路的磷酸化减轻足细胞炎症。黄芩苷（40 mg/kg）可抑制EMT，从而缓解肾间质纤维化。NF-κB在内外因素刺激下从i-κB解离，促发炎症级联反应。黄芩苷（5 μmol/L、10 μmol/L）通过减少i-κB与NF-κB的解离，抑制Janus激酶2（JAK2）对其下游信号转导和转录激活因子3（STAT3）的磷酸化，从而抑制包括TGF-β在内的多种纤维化因子的激活，进而减轻上述通路导致的核移位，减轻人肾近端小管上皮细胞纤维化。

2.4 调节肠道微生物

DN患者存在着明显的肠道菌群失调，细菌丰度和多样性下降。短链脂肪酸（SCFAs）主要由肠道微生物分解纤维素产生，可以为结肠杆菌提供能量，抗炎症反应、氧化应激、抑制细胞凋亡，保护肾功能。DN人群产SCFAs的细菌数量显著降低。同时，肠道微生物失调产生的有毒代谢物例如LPS、次生胆汁酸（SBAs）等，可加剧炎症相关疾病进展，从而加剧肾脏损伤。芩连药对在肠道细菌的水解糖苷键、去甲氧基化等作用下发生相应变化，在升高双歧杆菌、肠道乳杆菌数量的同时，可抑制肠杆菌和肠球菌生长，且二药配伍后比单味药吸收和消除时间更长。黄连解毒汤（包含黄连12 g、黄芩12 g及其他）可改善T2DM患者的糖脂代谢，同时肠道厌氧菌数量（乳杆菌、双歧杆菌、拟杆菌）升高，需氧菌数量（肠球菌、肠杆菌、酵母菌）降低。芩连药对（8.4 g/kg、4.2 g/kg、2.1 g/kg）增加T2DM模型鼠肠道微生物数量及种类，增加SCFAs产生，减轻肠道黏膜损伤。芩连药对和黄芩、黄连单药均可增加T2DM大鼠SCFAs的含量，减少SBAs的生成，并同时显示出瘤胃球菌、普雷沃氏菌等富集，大肠杆菌-志贺氏菌等的丰度降低，且上述效果在二药配伍组更显著。黄连解毒汤（2 g/kg）通过降低db/db小鼠肠道拟杆菌门/厚壁菌门值，下调变形菌门、螺杆菌属、理研菌属的丰度，上调乳杆菌属、拟杆菌属、普雷沃氏菌、另枝菌属的丰度，实现了降低体质量和血脂的作用。小檗碱（100 mg/kg）可降低慢性肾脏病SD大鼠的血清肌酐和尿素氮，减缓肾小球结构损坏，增加拟杆菌的丰度，增加产SCFAs菌属丰度。对甲酚和三甲胺属于尿毒症毒素，在体外研究中小檗碱（50 mg/L、100 mg/L、200 mg/L）可抑制肠道酪氨酸-对甲酚代谢途径，减少粪便中对甲酚硫酸盐和血液中的三甲胺的含量。小檗碱（136.5 mg/kg）可增加SCFAs，减少条件致病菌（变形杆菌、普雷沃氏菌等），减轻肠道炎症，缓解肠道黏膜屏障功能的损伤。以上实验证明，芩连药对可通过调节肠道菌群发挥降糖作用和改善肾功能作用。

2.5 调控基因转录

研究发现，DN的发生与基因转录密切相关。微小RNA（miRNA）通过激动或沉默相关信号通路调节DN的发病和进展。高糖所导致的组蛋白甲基化和乙酰化，及所致的促炎或促纤维化等基因的表达上调，可导致肾脏的组织损伤和功能失常。芩连药对和黄芩、黄连单药可逆转高糖诱导的MAPK及其下游因子以及PI3K、Akt2的信使RNA（mRNA）表达抑制，且药对组效果更显著。小檗碱（10 μmol/L）可逆转高糖诱导的长链非编码RNA（LncRNA）Gas5下降，抑制线粒体活性氧产生，减轻肾小管损伤。黄芩苷（15 mg/kg、30 mg/kg、45 mg/kg）通过上调miR-124，抑制TLR4/NF-κB的通路激活，抑制Col-Ⅳ和纤维连接蛋白（FN）表达，预防肾小管上皮细胞纤维化。黄芩苷（50 mg/kg、100 mg/kg、200 mg/kg）还可通过过表达miR‑124，抑制促炎性细胞因子的表达，减轻肾组织损伤，降低DN小鼠的死亡率。

芩连药对出自中医经典，用药历史悠久，现代在DM及其并发症的治疗中广泛应用。国内外众多研究发现芩连药对及其主要成分小檗碱、黄芩苷具有治疗DN的作用，主要是通过调节糖脂代谢紊乱、减少肾脏细胞凋亡、缓解肾脏炎症和纤维化、调节肠道微生物和调控基因转录等多方面缓解肾组织和细胞以及肾功能的损伤。尽管目前对芩连药对的研究已经取得一部分进展，但仍存在一些需要深入探索的问题。首先，现在机制研究主要集中在对单药成分的研究上，对药对和复方的机制探索相对缺乏。其次，目前研究主要集中在实验室研究，而临床研究相对缺乏。因此，应多学科相关联进行研究，明确芩连药对的活性成分、作用机制、药代动力学等方面的系统理论，推动芩连药对更广泛更便捷地运用于临床，将有益于全国乃至全球的DN患者。