猪中检测到高致病性基因1型和2型重组非洲猪瘟病毒

摘要：

非洲猪瘟病毒(ASFV)对全球养猪业和粮食安全构成重大威胁。目前，已经报道了24种ASFV基因型。在本研究中，我们在中国猪中检测到了三种基因型重组ASFV。这些重组体在遗传上相似，并根据其B646L基因归类为基因I型，但占其基因组56%以上的10个离散片段来自基因II型病毒。用其中一种重组病毒进行的动物实验表明，重组病毒在猪中具有较高的致死率和传播力，并且删除了来自基因II型强毒的毒力相关基因MGF_505/360和EP402R，可大大降低其毒力。由基因II型ASFV衍生的减毒活疫苗对重组病毒的攻击没有保护作用。这些自然发生的基因I型和II型非洲猪瘟病毒重组体有可能对全球养猪业构成挑战。

结果

从中国田间样本中检测到基因I型和II型重组ASFV

在监测过程中，我们分别从江苏省、河南省和内蒙古自治区采集的猪样本中分离到3种ASFV，并将其命名为猪/江苏/LG/2021 (JS/LG/21)、猪/河南/123014/2022 (HeN/123014/22)和猪/内蒙古/DQDM/2022 (IM/DQDM/22)。根据B646L基因序列，我们将这些病毒鉴定为基因I型(图1)。然而，我们惊讶地发现这些病毒都是HAD（红细胞吸附）阳性，因为之前在中国检测到的基因I型病毒都是HAD阴性。ASFV的HAD阳性表型主要由CD2v蛋白的完整性决定，该蛋白由EP402R基因编码。因此，我们对这三种病毒的EP402R基因进行了测序，发现它们的EP402R基因与中国第一个分离到的基因II型病毒HLJ/18具有100%的同源性，而与中国检测到的基因I型病毒SD/DY-I/21只有81%的同源性。

图1新出现的重组非洲猪瘟病毒的基因组分析。a基于GenBank数据库中8种不同基因型的3株重组ASFV和56株参考ASFV的全基因组序列。b两个重组片段连接区域的特异性单核苷酸多态性。采用SnapGene软件将3种重组ASFV的全基因组与代表性NH/P68-like基因I型 ASFV SD/DY-I/21和Georgia07-like基因II型ASFV HLJ/18进行比较。来自基因I型ASFV的重组片段以蓝色标记，来自基因II型ASFV的重组片段以粉红色标记。c利用BLAST Ring Image Generator用JS/LG/21全基因组序列构建重组ASFV图谱。

重组病毒JS/LG/21在猪中具有高致死率和传染性

在新型重组病毒中，来自高毒力基因II型病毒的10个独立片段携带106个ORFs。值得注意的是，其中一些基因是毒力决定因素，如EP402R基因和MGF_505/360区域的6个基因(MGF_505-1R、MGF_505-2R、MGF_505-3R、MGF_360-12L、MGF_360-13L和MGF_360-14L，我们在本报告中将这6个基因称为“MGF_505/360基因”)。为了研究来自致死性基因II型病毒的基因是否与重组ASFV的致病性和传播性有关，将6头7周龄SPF猪分别接种10³HAD50或10⁶ HAD50的JS/LG/21病毒。每组接种猪同时饲养2头未接种猪，以评估病毒的传播能力。每天监测猪的临床体征。从接种后第3天(p.i)开始，每隔一天采集一次猪的口腔、直肠拭子和血液，采用qPCR检测病毒血症和排毒情况。

在10⁶HAD50组中，所有6头接种猪在接种后第4天开始发烧，并在接种后第5天至第8天之间死亡。两只接触猪在接触后第9天开始发烧，并在接触后第12天死亡(图3)。在所有接种猪和接触猪的口腔拭子、直肠拭子和血液中检测到病毒DNA(图3)。在死猪的器官，包括脑、心、肝、脾、肺、肾和扁桃体，以及三个不同的淋巴结(腹沟淋巴结、颌下淋巴结和纵隔淋巴结)中也检测到高水平的病毒DNA(图3)。在10³ HAD50组中，接种猪在第4天出现发烧。所有猪均在接种后第6天至第15天死亡(图3)。两只接触猪分别于接触后第9天和第10天开始发烧。1头在第12天死亡，另一头在第14天死亡。在所有接种猪和接触猪的口腔、直肠拭子、血液和所有器官中也检测到病毒DNA，但水平略低于10⁶ HAD50组(图3)。这些结果表明重组病毒JS/LG/21在猪中具有高致死性和传染性。

图3重组非洲猪瘟病毒JS/LG/21在猪中的致病性和传播性.每组6头SPF猪分别接种JS/LG/21的10⁶HAD50 (a-f)或10³HAD50 (g-l)，从接种第一天起，每组饲养2头SPF猪。每天监测猪的直肠温度(a、g)和存活率(b、h)。在指定时间点采集口腔拭子(c, i)、直肠拭子(d, j)和血液(e, k)，并采集死猪组织样本(f, l)，采用qPCR进行病毒DNA检测。黑色虚线表示猪的正常直肠温度(40℃)。LN1，腹股沟淋巴结;LN2，颌下淋巴结;LN3，纵隔淋巴结。

来自Georgia07-like基因II型病毒的MGF_505/360基因和EP402R基因是重组病毒高毒力的重要原因

许多基因已被证明对ASFV的毒力起重要作用。先前的研究表明MGF_505/360和EP402R是基因I型和II型ASFV的重要毒力因子。NH/P68-like基因I型病毒对猪的毒力较低，而Georgia07-like基因II型病毒对猪的毒力高。三个重组分离株的基因组片段中，43.5%来自NH/P68-like基因I型病毒，56.5%来自Georgia07-like基因II型病毒。然而，重组分离株在猪身上表现出与Georgia07-like基因II型病毒相同的致死率。MGF_505/360和EP402R基因在NH/P68-like病毒中存在天然缺陷。在本研究中，所有三个重组分离株均含有来自高致死性Georgia07-like基因II型病毒的MGF_505/360基因和EP402R基因。

重组病毒JS/LG/21可以逃避基因II型ASFV减毒活疫苗的免疫

先前的研究表明，在低毒力ASFV感染中存活的猪产生保护性免疫，提供对同源病毒感染的抵抗力，但对异源病毒感染没有抵抗力。通过删除6个MGF_505/360基因和编码CD2v的EP402R基因，制备了一种减毒活疫苗HLJ/18-7GD，并在猪身上进行了研究，证明该疫苗对II型ASFV具有安全性和有效性。这种候选疫苗能对新出现的重组病毒提供保护吗?为了回答这个问题，每组5只SPF猪肌肉注射10⁶TCID50的HLJ/18-7GD，然后在接种后第28天肌肉注射10³ HAD50的重组病毒JS/LG/21或基因II型病毒HLJ/18。4头未接种疫苗的猪作为对照组被攻毒。

与我们之前的报道类似，对照组猪出现高热，并在HLJ/18攻毒后10天内全部死亡，并且在主要器官和淋巴结中检测到病毒DNA(图5)。相比之下，接种疫苗的猪对同源病毒HLJ/18攻毒有很好的保护作用，猪在28天观察期内没有出现临床症状,尽管在观察期结束安乐死时在1头猪的肺、肾、两个淋巴结和3头猪的扁桃体中检测到了病毒DNA(图5)。对照组猪受到重组病毒JS / LG / 21感染后8日内出现发烧和死亡,在主要器官和淋巴结中检测到了病毒(图5);然而，我们惊讶地发现，所有接种疫苗的猪也出现发烧并在10天内死亡(图5)，其器官中的病毒复制水平与对照组相当(图5)。这些结果表明，减毒活疫苗HLJ/18-7GD不能提供对新出现的重组ASFV的保护。

图5 HLJ/18-7GD疫苗对不同ASFV攻毒的保护作用.每组5头SPF猪分别接种10⁶ TCID50 HLJ/18-7GD，然后在接种后第28天肌内注射10³ HAD50 HLJ/18(a-c)或重组病毒JS/LG/21 (d-f)。每组4头未接种疫苗的SPF猪作为对照。每天监测直肠温度(a、d)和存活率(b、e)，观察期结束时采集死猪或安乐死猪的组织样本(c、f)，采用qPCR检测病毒DNA。黑色虚线表示猪的正常直肠温度(40℃)。