2020年中国自然发生的低毒力非洲猪瘟病毒的出现和流行情况（1）
摘要：
本文报告了2020年6月至12月在中国7个省份的非洲猪瘟监测情况。共分离到22株基因II型ASFV，与国内最早分离的Pig/HLJ/2018 (HLJ/18)相比，所有分离株均出现突变、缺失、插入或短片段替换。11个分离株EP402R基因有4种不同类型的自然突变或缺失，并表现出非红细胞吸附(non-HAD)表型。对4株分离株进行了猪毒力测试;其中两株被发现与HLJ/18一样具有高致病性。然而，两个non-HAD分离株表现出较低的毒力，但具有高度传染性;106 TCID50剂量感染为部分致死，引起急性或亚急性疾病，103TCID50剂量感染为非致死、亚急性或慢性疾病。低毒力自然变异株的出现给非洲猪瘟的早期诊断带来了更大的困难，也给非洲猪瘟的控制带来了新的挑战。
结果
中国非洲猪瘟病毒监测
2020年，在监测期间，从中国7个省(黑龙江、吉林、辽宁、山西、内蒙古自治区、河北和湖北)的农场、屠宰场和无害化处理场共收集了3660份样本。样本包括582份口腔和直肠拭子、1057份血液样本、1211份脾和淋巴结样本以及810份环境样本。所有样本均按照世界动物卫生组织的建议，采用qPCR检测病毒p72基因。采用原代猪肺泡巨噬细胞(PAMs)用于ASFV DNA阳性样本的病毒分离。从这些样本中共分离出22株ASFV(表1)。
表1 2020年在中国分离出的非洲猪瘟病
2020年中国非洲猪瘟分离株遗传分析
为了分析22株分离株的遗传进化，从病毒基因组DNA中扩增出23个开放阅读框(ORFs)或区域，包括重要的抗原基因、毒力决定基因和高频突变区域，进行测序。序列分析表明，22株分离株的B646L基因(编码p72蛋白)序列与HLJ/18完全一致，属于基因II型。在23个ORFs或区域中，有15个ORFs或区域之间没有差异。对于其他8个ORFs或区域，检测到核苷酸突变或缺失等序列差异。
把编码CD2v蛋白的EP402R基因序列与HLJ/18的序列进行比较，发现22株ASFV分离株中有11株发生突变或缺失。HLJ/ HRB1/20病毒EP402R基因43-67位点缺失25个核苷酸。9株分离株(HLJ/JMS3/20、HLJ/JMS5/20、HLJ/JMS9/20、HLJ/JMS11/20、HLJ/BLA3/20、HLJ/ BLA6/20、HuB/1/20、HuB/4/20和HuB/SP1/20)存在G131A突变，其中3株湖北分离株存在另外的G178A和G242A两个突变，HeB/Q3/20存在C301T突变(图1)。这些突变或缺失阻止病毒翻译完整的CD2v蛋白。考虑到CD2v是红细胞吸附(HAD)活性所必需的，这11个分离株的EP402R基因的这些突变和缺失导致非HAD表型，这被HAD试验证实(表1)。
图1 2020年中国22株田间分离的ASFV存在核苷酸插入、缺失、突变和替换。将22株ASFV的8个ORFs或相关区域与中国第一株ASFV分离株HLJ/18（Pig/HLJ/2018）相应序列进行比对。ORF或区域的名称标注于每部分的上方。
非洲猪瘟病毒分离株的体外鉴定
选取4株ASFV分离株HuB/628/20、HLJ/44/20、HLJ/HRB1/20和HeB/Q3/20进行体外生物学鉴定。用分离株感染PAMs，接种24 h后用免疫荧光法(IFA)进行分析。结果表明，四种病毒均能有效感染PAMs(图3A)。HuB/628/20和HLJ/44/20表现出典型的HAD表型，而HeB/Q3/20和HLJ/HRB1/20则完全丧失了HAD能力(图3A)，这与遗传分析结果一致。电镜(EM)观察显示，四个分离株在形态上没有明显差异(图3A)。为了评估病毒的动态生长，在感染倍数(MOI)为0.1时感染PAMs，收集细胞上清液，并在感染后不同时间点通过qPCR评估病毒滴度。结果表明，四种病毒在PAMs中有效复制，p72基因拷贝数在感染后120 h大于108拷贝/ mL(图3B)。
图3筛选出的ASFv体外特性分析。A，所选分离株HuB/628/20、HLJ/44/20、HLJ/HRB1/20和HeB/Q3/20感染PAMs, MOI为0.1。将细胞固定并在感染后24 h用IFA进行分析。对分离株进行HAD测定。PAMs接种于6孔板，接种ASFv (MOI=0.2)。收集细胞微球，用电镜进行形态学评估。B，分离株在PAMs中的病毒生长曲线。在MOI为0.1时感染原代PAMs，收集上清液，采用qPCR定量检测病毒p72基因拷贝数。
未完待续.....
文章来源：
翻译：王圣伟；编辑：王瑞爱
