Hello! 今天我很高兴地向大家介绍一个令人振奋的R包——RNAseqStat2。这款工具简直是生物信息学分析的利器，只需一行命令，便能轻松应对RNA-seq的下游分析挑战。接下来，果叔将带你们进入RNAseqStat2的实战应用，分分钟教会你们如何得到漂亮的结果图！作为在生物信息学领域摸爬滚打多年的我，非常乐意与大家分享我的经验和知识。若您在进行生物信息学分析时遇到难题，随时欢迎向我寻求帮助。
如何使用一行代码便捷地进行差异分析和富集分析呢？别急，今天果叔就用一段代码来示范，手把手教你们如何驾驭RNAseqStat2，让你们在RNA-seq数据分析的征途上，轻松愉快地收获那些令人惊艳的可视化成果！
在我们深入探索R包的无限可能时，果叔注意到，某些强大的R包在运行时可能会对您的计算机内存提出较高的要求。果叔在这里为您提供了一系列性价比极高的服务器租赁选项，旨在满足您从轻量级到重量级的数据分析需求。
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l一：安装以及加载R包
library(devtools)devtools::install_github("xiayh17/RNAseqStat2")
l二：模式生物，一步完成分析
模式生物只需要按照示例数据整理文件即可，下载对应的OrgDB包，一行命令即可出图，非常的简单。如果是Human, Mouse,Rat 之一，整体分析非常简单，短短几行即可完成全部分析，以airway的数据为例（R中的airway数据集是一个RNA测序数据集，它包含了四个人类气道平滑肌细胞系（airway smooth muscle cell lines）在接受地塞米松（dexamethasone，一种糖皮质激素）处理后的基因表达数据。
library(RNAseqStat2)library(airway)data("airway")row_counts <- as.data.frame(assay(airway))group_list <- as.character(colData(airway)$dex)data_i <- Create_DEGContainer(species = "Human",dataType = "Counts",idType = "ENSEMBL",expMatrix = row_counts,groupInfo = group_list,caseGroup = "trt")# 一步运行data_o <- runALL(object = data_i,dir = "output_test")
在这里果叔提醒大家，如果是其他物种，需要根据科学问题而设置参数，下载对应的OrgDB包。
data_i <- Create_DEGContainer(species = "pig",dataType = "Counts",idType = "SYMBOL",expMatrix = row_counts,groupInfo = group_list,caseGroup = "NBW",OrgDb="org.Ss.eg.db",organism="ssc",msi_species="Sus scrofa")
l三：非模式物种构建对象
小众的非模式生物甚至都没有合适的Org.Db数据库。这个时候就需要自己准备一些文件，包括注释文件等。小花这边来详细讲解一下。
首先需要准备5个初始文件，包括原始表达量矩阵和注释文件。对于非模式植物，获取GO（Gene Ontology）和KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）注释文件的方法通常涉及以下几个方法：一、使用EGGNOG-Mapper进行注释：对于非模式物种，可以使用EGGNOG-Mapper来快速进行GO或KEGG注释。注释结果文件中将包含序列映射上的GO号或KO号。二、可以将蛋白文件上传到KEGG注释的网站（https://www.genome.jp/tools/kofamkoala）中进行注释。初始文件如下：
准备好文件即可开始构建对象
library(RNAseqStat2)library(dplyr)row_counts <- read.delim("SRD.txt", header=TRUE, sep = " " , row.names=1)group_list <- c("SRRR","SRRR","SRRR","SDDD","SDDD","SDDD")GO_anno <- read.csv("gene_go_annotation_from_ipr_nr.tab", sep = "\t", header = FALSE, check.names = FALSE)GO_description <- read.csv("go_term.list", sep = "\t", header = FALSE, check.names = FALSE)KEGG_anno <- read.csv("kegg_gene.txt", sep = "\t", header = FALSE, check.names = FALSE)KEGG_description <- read.csv("kegg_description.txt", sep = "\t", check.names = FALSE, header = FALSE)data_i <- Create_DEGContainer(expMatrix = row_counts,groupInfo = group_list,caseGroup = "SDDD",species = "unknow",GOTERM2GENE = GO_anno,GOTERM2NAME = GO_description,KEGGTERM2GENE = KEGG_anno,KEGGTERM2NAME = KEGG_description)data_o <- runALL(object = data_i,dir = "output")
#这里果叔给大家介绍一下函数包含的参数：
expMatrix 处理好的表达矩阵
species 物种名 比如 Human Mouse Rat 或者其他
groupInfo 分组信息 每个样本对应哪个分组
caseGroup 实验组 哪个分组是实验组
GOTERM2GENE、GOTERM2NAME、KEGGTERM2GENE、KEGGTERM2NAME为注释文件信息
MSigDB（Molecular Signatures Database）是一个包含成千上万个注释基因集的数据库，分为人类和鼠类基因集，并且可以通过其官方网站进行访问和使用。我们的物种为非模式生物，这步会出现提醒，可以忽略。
object为构建的对象，dir设置结果文件的保存路径，结果包括样本间的PCA图、热图、分布图、火山图、top差异基因的表达热图、多种方法的Venn图等。
l四：结果解读
构建好对象后仅需一步即可完成全部的下游分析！接下来果叔带大家解读一下结果哦～
1-run_check
PCA图
横纵坐标：两个维度
boxplot图
横坐标：样品名
纵坐标：log2(cpm(count)+1)
相关性图
分布图
boxplot图的另一个视角，转换了x，y轴
热图
横坐标：样本
纵坐标：基因
前1000个基因绘制热图
2-runDEG
热图
三种方案前500个基因绘制的热图
火山图
横坐标：log2（Fold Change）
纵坐标：-log10（p-value）
离散图
横坐标：标准count数的平均值
纵坐标：离散度
质控RAWvsNORM图
维恩图
三个图分别为下调基因、上调基因和差异基因
3-runHyper
富集分析结果的柱状图
圈图
外围紫色代表q值，往内绿色代表count数，再往内彩色代表不同的通路，内部相同的通路用线连接。
4-runGSEA
标题：表示不同通路
第一部分：
折线图：离垂直距离x=0轴最远的峰值便是基因集的ES值，峰出现在排序基因集的前端（ES值大于0）则说明通路上调，出现在后端（ES值小于0）则说明通路下调。
第二部分：
中间从蓝色到红色的过渡“带”表示基因从上调到下调排列（排序可以按照fold change,也可以是p-value)。黑色像条形码的竖线表示该位置的基因属于某个指定通路。绿色有波动的曲线表示富集分数，从0开始计算，属于基因通路增加，不属于则减少。最后看下黑色的条形码是不是富集在一端。
第三部分：
表示每个基因对应的信噪比（Signal2noise）。
排序后所有基因rank值（由log2FoldChang值计算得出）的分布，以灰色面积图显展示。
以上内容便是对RNAseqStat2包的详尽介绍及其基本使用方法的演示，怎么样，你学会了嘛！？如果小伙伴有其他数据分析需求，可以尝试使用本公司新开发的生信分析小工具云平台，零代码完成分析，非常方便，云平台网址为：(http://www.biocloudservice.com/home.html)
果叔今天的分享就暂告一段落，非常期待与你一起探讨学习更多生物信息学的知识！如果你有任何疑问或建议，随时欢迎与果叔交流。我们下期再见，期待你的再次光临！
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