食品加工用遗传修饰微生物安全性评价申报材料要求

（试行）

申请人申报使用遗传修饰微生物生产新食品原料、食品添加剂新品种和食品相关产品新品种（以下简称“三新食品”），产品中不含有新引入基因片段和遗传修饰微生物时，应按本文件提交相关资料。

1. 产品信息

1.1 产品的组成、目标产物含量等检测数据

1.2 产品中外源基因残留检测数据

应详细描述生产过程中去除外源基因的处理工艺步骤和参数，并提供产品中无外源引入基因残留的检测报告。采用聚合酶链式反应（PCR）方法对生产菌株的特定脱氧核糖核酸（DNA）片段（包括目的基因、报告基因、标记基因等）进行检测。PCR方法涉及的样品采集、DNA提取、PCR扩增和质量控制要求见附件1。

1.3 产品中遗传修饰微生物残留检测数据

应详细描述生产过程中灭活和去除遗传修饰微生物的工艺步骤和参数，并提供产品中无遗传修饰微生物活细胞残留的检测报告。采用微生物培养法对产品进行遗传修饰微生物活细胞检测。具体的样品采集、样品前处理、培养和观察、菌落计数、质量控制和鉴定确认要求见附件2。

1.4 环境风险控制措施及效果

应提供无环境释放风险承诺书及其支持资料，包括但不限于生产过程中确保遗传修饰微生物及其外源基因不会进入环境和发生基因转移的防控措施，及其效果评价数据和报告（如生产过程中产生的废气、废水、废渣中无可繁殖、可转移的遗传修饰微生物残留的至少3批次检测数据）。

1.5 产品分类说明

依据以上数据及报告，对产品做出分类。Ⅰ类为纯化产品，Ⅱ类为复合产品。

2. 遗传修饰微生物相关信息

2.1 基本信息

名称（包括中文名、拉丁名、别名等）、菌株号、来源及用途。

2.2 分类学及鉴定资料

提供基于表型、基因型和最新测序技术鉴定到种或亚种水平的鉴定报告。

2.3 生物学特性资料

包括但不限于遗传修饰微生物的表型及显微镜下特征、理化特性等。

2.4 生长环境条件资料

提供遗传修饰微生物生长的适宜培养基及培养条件（包括但不限于培养时间、培养温度和湿度、需氧情况、光照等），以及遗传修饰微生物保藏及复壮方法等相关资料。

2.5 其他国家法规资料

提供其他国家已经批准或认可的该遗传修饰微生物生产产品的相关法规资料。

2.6 食品加工用遗传修饰微生物的安全性评价

2.6.1 遗传修饰微生物在自然界的存活能力，遗传物质转移到其他生物体的能力和可能后果；

2.6.2 遗传修饰微生物的安全性

（1）基于全基因组测序进行的毒力基因、耐药基因、毒素产生相关基因等分析；

（2）遗传修饰微生物的致病性、耐药性和产毒能力试验报告；

（3）遗传修饰微生物新引入基因表达产物应提供与已知毒性蛋白或毒素的同源性生物信息学比对资料，以及与已知致敏原的同源性生物信息学比对资料；

（4） 遗传修饰微生物新引入基因表达产物为非蛋白质类的产品，还应提供至少3批次样品蛋白残留数据；

（5）结合全基因组测序数据，分析潜在的脱靶位点与脱靶情况，如有脱靶情况发生，应分析可能造成的非预期效应；

（6）其他安全性资料。

2.6.3 确定遗传修饰微生物的安全等级。

3. 受体微生物的安全性评价

3.1 背景资料

3.1.1 名称（包括中文名、拉丁名、别名等）、菌株号、来源；

3.1.2 分类学资料；

3.1.3 明确是天然野生菌种还是人工培养菌种，如为人工培养菌种，应提供原始菌株的信息；

3.1.4 安全性背景资料：包括但不限于在国内外的应用情况，长期安全应用记录，对人类健康或生态环境是否产生过不良影响，是否有演变为有害生物的可能性。

3.2 生物学特性

3.2.1 生长周期和世代时间；

3.2.2 繁殖方式和繁殖能力；

3.2.3 适宜生长的营养要求；

3.2.4 在环境中定殖、存活和传播的方式、能力及其影响因素；

3.2.5 对人体健康和动物的潜在风险（包括毒性、致病性、耐药性等）；

3.2.6 其他生物学特性。

3.3 适应的生态环境

3.3.1 在国内的地理分布和自然生长环境，其自然分布是否会因某些条件的变化而改变；

3.3.2 生长所需的生态环境条件，包括温度、湿度、酸碱度、光照、空气等；

3.3.3 是否具有生态特异性，如在环境中的适应性等；

3.3.4 与生态系统中其他微生物的生态关系，是否受人类和动物病原体（如病毒）的侵染。包括生态环境的改变对这种（些）关系的影响以及是否会因此而产生或增加对人类健康和生态环境的不良影响；

3.3.5 对生态环境的影响及其潜在风险。

3.4 遗传变异

3.4.1 遗传稳定性；

3.4.2 质粒状况，质粒的稳定性及其潜在风险；

3.4.3 转座子状况及其潜在风险；

3.4.4 是否有发生遗传变异而对人类健康或生态环境产生不良影响的可能性；

3.4.5 在自然条件下与其他微生物（特别是病原体）进行遗传物质交换的可能性。

3.5 其他资料

3.6 安全等级

4. 基因操作的安全性评价

4.1 食品加工用遗传修饰微生物中引入或修饰性状和特性的描述

4.2 实际插入或删除序列的资料

4.2.1 插入序列的大小和结构，确定其特性的分析方法；

4.2.2 删除区域的大小和功能；

4.2.3 目的基因的安全性；

详细描述目的基因的供体来源、核苷酸序列和推导的氨基酸序列、功能和安全性。

（1）结构：完整的DNA或反转录脱氧核糖核酸（cDNA）序列和推导的氨基酸序列；

（2）供体微生物的来源；

（3）供体微生物的生物学特性及生物学功能等；

（4）安全性：从供体微生物特性、安全使用历史、基因结构、毒性、致病性、耐药性、功能等方面综合描述目的基因的安全性。

4.2.4 插入序列的拷贝数。

4.3 载体信息

载体的名称和来源，载体特性和安全性，是否可向自然界中不含有该类基因的微生物转移。构建载体图谱，详细注明表达载体所有元件的名称、位置和酶切位点。

4.4 载体中插入区域各片段的资料

4.4.1 启动子和终止子的供体生物的名称、大小、DNA序列、功能、安全应用记录；

4.4.2 标记基因和报告基因的供体生物的名称、大小、DNA序列、功能、安全应用记录；

4.4.3 其他表达调控序列的名称及其来源（如人工合成或供体生物名称）、大小、DNA 序列、功能、安全应用记录。

4.5 基因操作方法

4.6 遗传稳定性

4.6.1 目的基因整合的稳定性：采用PCR等方法扩增外源基因片段，测定扩增产物的序列，分析外源基因片段的插入情况或微生物基因缺失情况，提供不少于转接传代5代的试验数据；

4.6.2 目的基因表达的稳定性：采用蛋白质印记（Western–Blot）、质谱、色谱等方法，分析表达产物中外源基因表达的稳定性，提供不少于转接传代5代的试验数据。

4.7 目的基因的检测和鉴定技术

4.8 确定基因操作的安全类型

附件1 食品加工用遗传修饰微生物产品中生产菌株DNA检测

采用PCR方法对生产菌株特定DNA片段（如目的基因、报告基因、标记基因等）进行检测。PCR方法涉及的样品采集、DNA提取、PCR扩增和质量控制要求如下：

1. 样品采集

每个遗传修饰微生物产品应至少包括3个批次，每个批次至少取3个样品进行检测。样品应从工业化生产线采集，记录采样点所处的具体生产环节。若尚无工业化产品，可采用中试产品，但应明确中试生产工艺（发酵及后处理工艺）具有工业化生产工艺的代表性。

2. DNA提取

从至少1 g（mL）样品中提取DNA。若上游发酵中间产品浓度高于终产品浓度，可使用上游发酵中间产品提取DNA。

应采用适合于生产菌株各类细胞形式（如菌体细胞、芽胞）的DNA提取方法，确保能从产品中提取到可能残留的DNA。

3. PCR扩增

针对生产菌株的特定DNA片段设计特异性引物，扩增产物不应超过1 Kb。应详细描述生产菌株的特定DNA片段、特异性引物、聚合酶以及扩增条件等信息。

若生产菌株含有作为报告基因/标记基因的耐药基因，可设计多对引物以确保扩增产物应覆盖耐药基因的完整DNA片段。

4. 质量控制

PCR检测时应当包括以下对照和灵敏度测试：

（1）将直接从生产菌株中提取的总DNA作为PCR扩增的阳性对照；

（2）不含目的基因的微生物DNA作为阴性对照；

（3）试验过程中为排除PCR抑制剂、核酸酶等的存在，将直接从生产菌株提取的总DNA添加至从样品中提取的DNA作为PCR扩增的质控对照；

（4）将直接从生产菌株提取的总DNA梯度稀释后，分别添加至样品中，提取DNA并进行PCR扩增，计算检测限；

（5）检测阈值应不高于10 ng DNA/g（mL）样品。

附件2 食品加工用遗传修饰微生物产品中无活体生产菌株评价

采用微生物培养法检测产品中是否存在遗传修饰微生物活细胞。具体的样品采集、样品前处理、培养和观察、菌落计数、质量控制和鉴定确认要求如下：

1. 样品采集

每个遗传修饰微生物产品应至少包括3个批次，每个批次至少取3个样品进行检测。样品应从工业化生产线采集，记录采样点所处的具体生产环节。若尚无工业化产品，可采用中试产品，但应明确中试生产工艺（发酵及后处理工艺）具有工业化生产工艺的代表性。

2. 样品前处理

每个样品至少取25 g（mL）进行前处理后制备检液。固体样品：取25 g，加入225 mL灭菌生理盐水，充分振荡混匀，使其分散混悬，静置后，取上清液作为1∶10稀释的检液。水溶性液体样品：取25 mL（g），加入225 mL灭菌生理盐水，混匀后制成1∶10稀释的检液。取1 mL上述检液于适宜的培养基中进行生产菌株活细胞培养检测，需设定10个平行样，用于计算1 g（mL）样品中待测微生物的含量。

3. 培养和观察

将上述平皿置于适宜的条件下培养一定时间后，观察生产菌株存活和生长情况。

4. 菌落计数

计算10个平行样平皿中待测微生物的菌落总数，并表示为1g（mL）样品中待测微生物的含量。

5. 质量控制

培养检测时，每批次样品应设置阳性对照，即在每批次的1个样品中接种较低数量的活体生产菌株（如每个平皿30~300个菌落），以证明所用培养基和培养条件适合于产品中活体生产菌株的生长。

应考虑检测方法的特异性，以避免样品中其他微生物的污染和干扰。

6. 鉴定确认

结果报告应提供菌落培养图片。

样品经培养后，若平皿上长出与阳性对照形态相似的菌落，应通过鉴定确认其是否为生产菌株。

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