华中农业大学国家重点实验室赵毓组 | 外源蛋白在烟草叶片瞬时表达
学术
科学
2024-12-28 09:01
北京
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利用农杆菌将外源基因导入到烟草叶片中进行表达，可以借此进行蛋白的亚细胞定位、蛋白互作(BiFC)和蛋白的纯化等实验操作。关键词：烟草 外源蛋白 瞬时表达
3. 本氏烟草 (Nicotiana benthamiana)7. 乙酰丁香酮 (acetosyringone, AS) (上海生工，catalog number: A601111)10. 0.5 M MES (pH 5.6) (见溶液配方)1. 挑取转化有表达质粒的农杆菌克隆(菌株：EHA105)于1 ml含有相应抗生素的LB中，28度摇床250 rpm培养24小时。2. 于5 ml含有相应抗生素的LB中，加入100 μl 0.5 M MES，2 μl 100 mM AS，再接种50 μl农杆菌菌液，28度摇床250 rpm培养至OD600=1.0 (大约12-18小时)。3. 4,000 rpm常温离心10分钟收集菌体，用10 mM MgCl2重悬至OD600=1.0，以每毫升菌液加入2 μl的比例加入100 mM AS，静置3小时以上。4. 取正处于生长旺盛时期(一个月左右，未开花)的本生烟草(Nicotiana benthamiana)，用注射器吸入菌液，去掉针头，以手指抵住叶片正面，将菌液从叶片的反面渗透进去(见图1)，若注射不顺畅，可用针头在叶片上制造一个微小的伤口，再将菌液从伤口注入。![]()
图1.烟草叶片农杆菌注射
5. 正常条件下放置，24-48小时即可取样。1. 有的文献报道烟草注射前需黑暗处理，有的文献则报道需要持续光照处理，个人经验至少对于蛋白表达这一操作来说不需要任何处理，正常条件生长即可，但是用于蛋白互作(BiFC)可能需要特定的条件，可参见BiFC部分 (参见“烟草体系BiFC”，袁猛等，2018)。2. 表达载体的启动子一般是35S，若需要特异基因自身的启动子驱动，需考虑水稻与烟草的单/双子叶植物的区别造成的差异。3. 一般情况下，转化后24小时即有蛋白表达，而48小时后会渐渐消失。4. 若需要提高外源蛋白的表达，可用同样的方法制备含有番茄丛矮病毒基因p19超表达载体的农杆菌，与目的基因的农杆菌等量混合后再注射烟草，此方法的蛋白表达时间为注射后3-7天，且可以大幅提高表达量，但是只适用于本生烟草 (Nicotiana benthamiana) (Voinnet等, 2003)。5. 如果要抽提并纯化蛋白在未用p19的情况下需5-10 g烟草叶片，加p19的情况下可以减半。MES粉末溶于双蒸水中，利用1 M KOH溶液调pH值至5.61. Voinnet, O., Rivas, S., Mestre, P. and Baulcombe, D. (2003). An enhanced transient expression system in plants based on suppression of gene silencing by the p19 protein of tomato bushy stunt virus. Plant J 33(5): 949-956.2. 袁猛，许纯珏等. (2018). 烟草体系BiFC. Bio-101 e1010133. Doi: 10.21769/BioProtoc.1010133. (in press)陈香嵩, 李甜甜, 周少立, 赵毓. (2018). 外源蛋白在烟草叶片瞬时表达. Bio-101: e1010127. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010127.
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