告别有损的体外检测,轻松实现生物酶活性原位无损测定

学术   科学   2024-12-30 07:31   北京  

本文通过ChatGLM/GPT进行辅助对近期Bio-protocol 期刊发表的方案进行解读和概括,若感兴趣请点击“阅读原文”查看详细的实验流程及试材。如果解读中有任何错误或遗漏,敬请指正

植物的“生长开关”TOR激酶在调控细胞生长和营养代谢中起着至关重要的作用,但由于技术限制,其在细胞和组织中的活性难以直接观察。以往的检测方法如Western blot需要破坏细胞,无法满足对亚细胞定位或组织特异性的研究需求。如今,一种免疫荧光技术为科学家们带来了解决方案——无需切片或破坏细胞,即可在体内定位和检测TOR信号。在这方面,2024年12月20日,Bio-protocol 期刊在线发表了阿根廷生物多样性和生物技术研究所(Instituto de Investigaciones en Biodiversidad y Biotecnología (INBIOTEC) and FIBA)团队题为“Immunofluorescence for Detection of TOR Kinase Activity In Situ in Photosynthetic Organisms”的方法文章。

图1. 文章标题页 https://doi.org/10.21769/BioProtoc.5140
关键词拟南芥 绿球藻 共聚焦显微镜 原位免疫荧光 S6K TOR活性

原位免疫荧光(Immunofluorescence in situ)一种基于抗体的检测技术,通过荧光标记的抗体在细胞或组织原位检测特定蛋白质或抗原的位置和表达情况。它结合了免疫学和显微镜技术,能够在保持细胞或组织结构完整的前提下,实现目标分子的高灵敏度和高分辨率可视化

雷帕霉素靶点(Target of Rapamycin, TOR)激酶通路是一个保守的信号网络,连接营养感应、翻译调控和生长调节。TOR通路中的S6激酶(S6K)及其靶标40S核糖体蛋白S6(RPS6)的磷酸化水平通常被用作TOR活性的可靠指标,这一检测方法常通过Western blot(WB)技术实现。然而,WB技术需要破坏细胞,无法提供亚细胞定位或组织特异性的信息。尽管在哺乳动物中已有相关免疫荧光检测的研究,但植物和藻类中尚缺乏类似技术,限制了对TOR活性在细胞和组织水平的研究。免疫定位方法能够在体内提供蛋白质的亚细胞定位及动态信息,适用于研究多层次调控通路。本文开发并验证了一种针对模式光合生物(拟南芥与衣藻)检测S6K磷酸化的免疫荧光方法,克服了传统技术的局限,为TOR信号通路在植物和藻类中的研究提供了新的工具


  • 无需破坏组织或细胞,通过免疫荧光实现对光合生物TOR活性的体内检测。

  • 该方法可同时用于植物(拟南芥)和藻类(衣藻),有较强的适用性。

  • 可结合细胞核、细胞壁等超微结构标记,提供细胞形态的详细信息。

—————文中代表性图—————

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图2. 实验流程图形概述(来自Bio-protocol期刊

图3. 五天龄拟南芥幼苗根尖中P-S6K的免疫定位(来自Bio-protocol期刊

图4. 衣藻中P-S6K的免疫定位(来自Bio-protocol期刊
  • 研究TOR信号通路
    用于解析TOR激酶在光合生物中的亚细胞定位和动态变化,揭示其信号调控机制。
  • 植物生长调控研究
    ‍帮助深入了解TOR通路对植物生长发育的影响,为农业和生态研究提供数据支持。
  • 营养感应机制探索
    通过监测TOR活性,研究植物如何响应外界营养信号,推动营养代谢研究。


个方法的可重复性已经被本文作者阿根廷生物多样性和生物技术研究所(Instituto de Investigaciones en Biodiversidad y Biotecnología (INBIOTEC) and FIBA)团队验证过,相关实验数据与结果发表在Planta,DOI:10.1007/s00425-024-04542-8

温馨提示:积极引用本文不仅是对作者创新技术和科研共享的最佳肯定,也是确保实验可复现性的重要方式。

Lando, A. P., De Marco, M. A., Cumino, A. C. and Martínez-Noël, G. M. A. (2024). Immunofluorescence for Detection of TOR Kinase Activity In Situ in Photosynthetic Organisms. Bio-protocol 14(24): e5140. DOI: 10.21769/BioProtoc.5140.

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