近年以PD-1/PD-L1抗体为代表的免疫检查点阻断疗法（ICB）成为最受关注的肿瘤免疫治疗手段，在临床中取得显著成果。TIM-3是继PD-1/PD-L1、CTLA-4之后，又一个重要的新兴免疫检查点分子，其在Th1、CTL、NK细胞和树突状细胞等多种免疫细胞上表达，并被视作慢性病毒感染和癌症中T细胞终末耗竭的重要标志，在PD-1抗体治疗抵抗个体中高表达。
多种小鼠肿瘤治疗模型使用Tim-3阻断抗体显示了良好的抗肿瘤作用，虽然目前已经有多个靶向TIM-3的药物进入临床试验，但均未获批上市。ICB靶向的是在细胞膜表达的免疫检测点分子。TIM-3表达是如何调控的？其表达模式是否存在特殊之处？目前仍尚未阐明。
山东大学马春红教授研究团队长期关注TIM-3，此前研究发现HBV慢性感染和炎症促进Tim-3的表达，调控多种免疫细胞的功能，导致免疫耗竭、加速炎癌转化，并表征了肝癌微环境中Tim-3介导的细胞空间互作网络；基于Tim-3配体结合位点，开发了增强抗肿瘤免疫的Tim-3小分子抑制剂（1-5）。
近日，围绕TIM-3表达调控机制，马春红教授和武专昌副教授（论文第一作者为博士生张召英）在Science系列期刊Science Immunology发表了题为“Palmitoylation of TIM-3 promotes immune exhaustion and restrains anti-tumor immunity”的研究工作，发现了棕榈酰化修饰在调控人TIM-3蛋白稳定表达及其介导免疫耗竭过程中的关键作用，为靶向TIM-3翻译后修饰的肿瘤免疫检查点治疗提供了新策略。
通过对人与小鼠CD8+T细胞活化后TIM-3表达模式的比较，研究者发现人TIM-3在活化T细胞膜上快速诱导并持续高表达（图1A）。进一步比对不同物种TIM-3蛋白序列，发现灵长类动物TIM-3胞质结构域尾部存在特有的11个氨基酸（11aa）（图1B）。有意思的是，11aa敲除导致人TIM-3稳定性和细胞膜表达的降低（图1C）。
图1. (A) 人与小鼠CD8+T细胞活化后的TIM-3动态表达变化；（B）不同物种TIM-3蛋白序列比对（胞内段）；（C）全长与11aa缺失的TIM-3蛋白半衰期
蛋白翻译后修饰在调控蛋白转运、稳定性和生物学功能中发挥重要作用。生信预测和修饰分析发现11aa中296位点Cys（C296）存在棕榈酰化修饰（图2A），此修饰对TIM-3膜表达和蛋白稳定性至关重要（图2B，C）。棕榈酰修饰缺失导致TIM-3被内质网中E3泛素连接酶HRD1识别、介导其K48连接的多聚泛素化修饰和蛋白降解。
图2. （A）TIM-3 C296位点棕榈酰化修饰示意图；（B，C）棕榈酰化酶抑制剂2-BP处理对TIM-3蛋白定位（B）及表达（C）的影响
棕榈酰化修饰由蛋白质酰基转移酶DHHCs家族介导。研究者筛选发现DHHC9是调控TIM-3蛋白棕榈酰化修饰和稳定表达的关键酶，其在肝癌浸润CD8+T和NK细胞上高表达，并与TIM-3的高表达和肝癌患者的不良预后密切相关（图3A，B）。
有意思的是，在靶细胞反复刺激诱导T细胞耗竭模型中，敲低DHHC9抑制TIM-3表达、逆转T细胞耗竭，说明DHHC9调控的TIM-3棕榈酰化修饰是TIM-3介导免疫效应细胞耗竭的重要原因。为进一步靶向阻断DHHC9介导的棕榈酰化TIM-3，通过蛋白结构和分子互作分析，设计开发了阻断TIM-3棕榈酰化的蛋白多肽。体内外实验证实，此多肽特异性抑制DHHC9结合和修饰TIM-3，有效提高CAR-T细胞和NK细胞的抗肿瘤功能（图4C，D）。
图3. （A）多色免疫荧光分析肝癌组织浸润免疫细胞的TIM-3与DHHC9表达；（B）肝癌浸润TIM-3+NK和CD8+T细胞中DHHC9表达水平与患者生存期；（C）TIM-3与DHHC9蛋白结构对接模拟分析；（D）棕榈酰化阻断肽对NK92细胞，CD19 CAR-T细胞过继免疫疗法的影响
此研究结果发现了此前未知的人TIM-3蛋白棕榈酰化修饰，揭示了TIM-3棕榈酰化调控机制及其决定TIM-3蛋白命运的关键作用，提出了靶向棕榈酰化修饰降解TIM-3以增强抗肿瘤免疫治疗的新策略。
通讯作者简介：武专昌副教授为马春红教授团队骨干成员，主要从事HBV感染、免疫与肝脏疾病研究，致力于发现HBV复制调控的关键宿主因子及靶向干预新策略，相关成果发表在Sci Immunol、Cell Death Differ、Adv Sci、Cell Mol Immunol、Signal Transduct Target Ther、Cell Mol Gastroenterol Hepatol、J Med Chem等国际知名期刊。
第一作者简介：张召英为马春红教授博士研究生，研究方向为肿瘤免疫治疗，相关成果发表在Sci Immunol、Signal Transduct Target Ther期刊。
参考文献：
1. Ju, Y., Hou, N., Meng, J., Wang, X., Zhang, X., Zhao, D., Liu, Y., Zhu, F., Zhang, L., Sun, W., et al. (2010). T cell immunoglobulin- and mucin-domain-containing molecule-3 (Tim-3) mediates natural killer cell suppression in chronic hepatitis B. J. Hepatol. 52, 322-329.
2. Yan, W., Liu, X., Ma, H., Zhang, H., Song, X., Gao, L., Liang, X., and Ma, C. (2015). Tim-3 fosters HCC development by enhancing TGF-β-mediated alternative activation of macrophages. Gut 64, 1593-1604.
3. Tan, S., Xu, Y., Wang, Z., Wang, T., Du, X., Song, X., Guo, X., Peng, J., Zhang, J., Liang, Y., et al. (2020). Tim-3 Hampers Tumor Surveillance of Liver-Resident and Conventional NK Cells by Disrupting PI3K Signaling. Cancer Res. 80, 1130-1142.
4. Wang, T., Zhang, J., Li, N., Li, M., Ma, S., Tan, S., Guo, X., Wang, Z., Wu, Z., Gao, L., et al. (2022). Spatial distribution and functional analysis define the action pathway of Tim-3/Tim-3 ligands in tumor development. Mol. Ther. 30, 1135-1148.
5. Ma, S., Tian, Y., Peng, J., Chen, C., Peng, X., Zhao, F., Li, Z., Li, M., Zhao, F., Sheng, X., et al. (2023). Identification of a small-molecule Tim-3 inhibitor to potentiate T cell–mediated antitumor immunotherapy in preclinical mouse models. Sci. Transl. Med. 15, eadg6752.
