肺炎支原体的检验方法汇总

文摘   2024-10-31 22:00   云南  

肺炎支原体主要侵犯呼吸系统,引发原发性非典型性肺炎。潜伏期 2~3 周,首先引起上呼吸道感染,然后下行引起气管炎、支气管炎、毛细支气管炎和肺炎。以隐性感染和轻型感染较常见,也可导致严重肺炎或伴发肺外组织、器官病变,如皮肤黏膜的斑丘疹、溶血性贫血、心肌炎、心包炎、脑膜炎或脑炎等。此外,致病性也与迟发性超敏反应有关。


生物学特性
1. 形态染色

肺炎支原体无细胞壁,最外层为细胞膜,呈高度多形态性,主要为丝状,长 2~5 um 在丝状体尖端有一特殊球状结构,有时可见球形或双球形的菌体,革兰染色镜检阴性,但不易着色,姬姆萨染色呈淡紫色。

2. 培养特性

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支原体生长缓慢,在液体培养基中有极微弱的混浊,在固体培养基上孵育 5~7 天后出现菌落。肺炎支原体的菌落较大,直径为 10~100 μm。初次分离时为细小颗粒状菌落,多次传代后形成典型「油煎蛋」样菌落,菌落中心较厚,向下长人培养基中,周边为一层薄而透明的颗粒区。菌落能吸附豚鼠红细胞;能产生溶血素,可迅速而完全地溶解哺乳动物红细胞。半固体培养基中呈现肉眼可见的细小粒状菌落。
3. 生化反应

肺炎支原体分解葡萄糖产酸,不分解精氨酸,尿素试验阴性。

4. 抗原与分型

支原体无细胞壁,其抗原性主要取决于细胞膜上的蛋白质和糖脂。糖脂的抗原性很强,但特异性较差,与多种其他支原体、细菌(如肺炎链球菌 23 型及 32 型、MG 链球菌)及宿主细胞(如人红细胞 I 型抗原)有共同的抗原决定簇

所有肺炎支原体均具有分子质量为 1.7X10
5
 Da 的 P1 外膜蛋白和 4.3X10 Da 的菌体蛋白,特异性强,可刺激机体产生持久的高效价抗体。肺炎支原体 P1 外膜蛋白是支原体的主要型特异性抗原,其抗原性可用 GIT 与 MIT 进行鉴定,通过该试验可将肺炎支原体分成若干血清型。部分肺炎支原体菌株在细胞膜外还有一层荚膜,主要成分是多糖,也具有一定的抗原性。

5. 抵抗力

℃ 放置不超过 3 天,56 ℃ 很快被灭活。对热于燥非常敏感,冻干能长期保存。因无细胞壁,对青霉素、头菌素等作用于细胞壁的抗生素不敏感,故常在分离培养中加人青霉素。对脂溶剂、去垢剂苯酚和甲醛等常用消毒剂敏感。

检测方法

肺炎病原体培养虽然作为金标准,但临床应用难度大。肺炎支原体、衣原体抗原或抗体检测,优点是耗时短,但灵敏度低,且疾病早期不易检出阳性。核酸检测在肺炎的病原诊断上具备一定优势,灵敏度高、特异性高、不受抗菌药物应用影响;对比分离培养,简便快速、缩短报告时间、满足临床时效性的需求,对比抗体,检测窗口期短,满足早期快速检测需求。

1. 检验程序


2. 标本采集

可采集患者痰液、咽拭子、鼻咽洗液、支气管洗液,血清标本等,肺炎支原体有黏附细胞作用,故以咽拭子标本为好。取材后应立即接种,或置转运培养基(蔗糖磷酸盐缓冲溶液)中,组织块应切碎或研磨后再接种。培养基中加入青霉素可抑制杂菌的生长。


3. 标本直接检查

3.1. 显微镜检查
革兰染色阴性,但不易着色。电镜下观察无细胞壁,可与细菌鉴别。

3.2. 核酸检测
PCR 检测主要包括普通 PCR 实时荧光定量 PCR 及巢氏 PCR 等,目前临床上以荧光定量 PCR 开展最为广泛。

4. 分离培养与鉴定

4.1. 分离培养

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4.2. 鉴定

肺炎支原体分解葡萄糖产酸,不利用精氨酸和尿素。在分离培养过程中,若呼吸道标本使含葡萄糖培养基 pH 缓慢降低,指示剂颜色随之改变,或生长的菌落发生红细胞吸附等,即可初步定,推测标本中存在肺炎支原体。

若在固体培养基上生长出典型「油煎蛋」样菌落,表明标本中有支原体生长,可疑菌落需根据其菌落特征、染色后镜检、生化反应以及 GIT、MIT 等血清学方法进行鉴定。

5. 抗体检测

抗体检测是目前检测支原体感染的主要手段,包括非特异性抗体检测和特异性抗体检测。

5.1. 非特异性抗体检测
主要采用冷凝集素试验。冷凝集素是人感染肺炎支原体后产生的一种 IgM 型自身抗体,4 ℃ 条件下可凝集人的 O 型红细胞,约 50% 的患者于发病后 1 周末或第 2 周初开始呈阳性反应(抗体效价不小于 1:64)。因该抗体也可见于流感病毒或腺病毒感染、溶血性贫血、传染性单核细胞增多症等,少数健康者也可呈阳性反应,故渐被特异性抗体检测方法所取代。

5.2. 特异性抗体检测主要有 ELISA、间接荧光免疫法、明胶颗粒凝集法、补体结合试验等检测肺炎支原体 IgM 或 IgG 抗体。ELISA 法快速、经济、敏感特异性高,采用分子质量为 1.7X105  Da 的 P1 蛋白和分子质量为 4.3X104 Da 的多肤检测相应抗体,是目前诊断肺炎支原体感染最常用的血清学方法。

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