Immunity︱突破！慕尼黑工业大学团队揭示小胶质细胞中聚集的载脂蛋白E通过种子β-淀粉样变性引起阿尔茨海默病病理

学术 2024-11-01 00:00 上海

【神经科学前沿技术培训系列】详见文末

撰文︱张远

责编︱王思珍

阿尔茨海默病（AD）发病前有一个临床前阶段，不溶性淀粉样蛋白-β（Aβ）会沉积为细胞外斑块[1]。这种淀粉样斑块的逐渐积累被认为会引发涉及多种细胞类型的病理级联，最终导致神经退行，记忆力和认知功能逐渐恶化[2,3]。错误折叠蛋白质聚集体的种子生长已成为AD以及其它神经退行性疾病的强大概念框架[4-7]。但究竟是什么引发了这种病理级联？基因分析表明，散发性AD的风险与在小胶质细胞和星形胶质细胞中表达的基因有关，这些基因对淀粉样蛋白的沉积作出响应[8-16]，但这些基因如何导致淀粉样变性尚不完全清楚。在已鉴定的易感基因中，载脂蛋白E（APOE）及其等位基因异构体APOE4的风险最大[11,17-19]。在健康的中枢神经系统（CNS）中，APOE主要由星形胶质细胞合成，与其他载脂蛋白类似，APOE通过溶解脂蛋白颗粒中的脂质发挥作用[20-22]。通过与低密度脂蛋白家族的不同成员相互作用，脂质化的APOE颗粒通过受体介导的内吞作用进入到细胞中，在细胞中脂质参与支持细胞活力、突触形成和膜延伸等过程[23-25]。除了在脂质稳态中的生理作用外，APOE还在神经系统疾病中发挥关键作用。几乎任何对中枢神经系统损伤（包括AD）导致小胶质细胞和星形胶质细胞反应性上调脂质代谢途径，特别是APOE[10,12,13,15]。在小鼠中的研究表明，APOE的缺失会导致纤维淀粉样斑块沉积减少，表明APOE可能在Aβ纤维化/稳定和/或聚集中发挥作用。

近日，德国慕尼黑工业大学Mikael Simons团队在Immunity杂志在线发表了题为“Apolipoprotein E aggregation in microglia initiates Alzheimer’s disease pathology by seeding β-amyloidosis”的研究论文。在这项研究中，研究者构建了一种小鼠模型来优化APOE的检测和纯化，这使研究者能够应用生化方法并在Aβ淀粉样变性小鼠模型中对APOE进行特异性成像。利用这一实验系统，研究者在小胶质细胞的溶酶体系统内发现了促进Aβ淀粉样变性的APOE纤维聚集体，并且这一过程受到免疫和脂质代谢调节。

为了提高APOE的可视化和纯化，研究者构建了与小鼠APOE融合的HaloTag（ApoE-Halo）的转基因敲入小鼠。研究发现纯合ApoE-Halo小鼠血清中的胆固醇和胆固醇酯浓度与野生型（WT）动物相当，而APOE缺陷（ApoE KO）小鼠中观察到胆固醇和胆固醇酯浓度升高（图 1A），从而验证了羧基末端标记APOE的生理功能。接下来，研究者使用Halo-Trap磁性琼脂糖对脑裂解物和血清中的Halo标记APOE进行了免疫纯化实验。该方法能够分离具有预期脂蛋白大小的颗粒，如电子显微镜（EM）所示（图1A）。接下来，研究者在ApoE-Halo小鼠的脑切片上应用荧光HaloTag配体，验证了星形胶质细胞是成人皮质中主要的APOE表达细胞群（图 1B），另外小胶质细胞和少突胶质细胞中也有一些表达。为了分析AD中的APOE，研究者将ApoE-Halo小鼠与5xFAD小鼠杂交。用甲氧基-X04（MX04)对纤维状β片层沉积物进行组织学标记来确定斑块数量和形态，使用二乙胺（DEA，可溶性部分）和甲酸（FA，不溶性部分）通过蛋白质印迹分析来确定可溶/不溶性Aβ的量，以及通过分析APP C末端片段（CTF）来检测淀粉样蛋白前体(APP)的裂解模式（图 1C-1E)。与对照小鼠（5xFAD）相比，5xFAD ApoE-Halo小鼠Aβ代谢没有差异。此外，5xFAD ApoE-Halo小鼠的APOE和小胶质细胞标记基因表达没有显著差异（图 1F）。这些结果与5xFAD小鼠与纯合或杂合ApoE KO小鼠杂交的结果形成对比，后者显示出预期的基因剂量依赖性组织学中Aβ沉积减少(图 1G）。5xFAD ApoE KO不溶性Aβ大幅减少和可溶性Aβ增加(图 1E)。此外，研究者使用荧光HaloTag配体检测5xFAD小鼠中APOE-Halo的细胞定位，发现5xFAD ApoE-Halo小鼠中APOE标记的阳性的小胶质细胞增加（图 1B、1H）。此外，APOE-Halo定位于皮质组织样本中的纤维状β片层阳性沉积物(MX04+)中（图 1H）。因此，研究者将ApoE-Halo敲入小鼠用于APOE的可视化和纯化，且经过验证不影响脂质和Aβ代谢。

图1. ApoE-Halo小鼠的生成和特征描述。