实验解析|PCR实验的常见问题及解决方案

文摘   2024-11-02 07:01   广东  


一、PCR实验概述

PCR,即多聚酶链式反应,是一种简单便捷且高效的DNA扩增技术。在PCR实验中,往往会出现一些异常问题,以下对常见的一些问题进行了分析,并给出了解决方案,希望对大家有所帮助。


二、常见问题及解决方案

1、假阳性

原因:可能是引物特异性不好/靶序列太短或引物太短或者靶序列或扩增产物出现交叉污染。

方案:

(1)引物设计完成以后,应对其进行BLAST检测。如果与其它基因不具有互补性,就可以进行下一步的实验;

(2)除酶及不能耐高温的物质外,所有试剂或器材均应高压消毒;

(3)操作时应小心轻柔,防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外;

(4)各种试剂最好先进行分装,然后低温贮存。


2、假阴性,不出现扩增条带

原因:引物设计有问题或者引物浓度不对或引物发生降解;模板含有抑制物,含量;Buffer对样品不合适;反应条件:退火温度太高,延伸时间太短。

方案:

(1)引物引物的浓度不仅要看OD值,更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳,一定要有引物条带出现,而且两引物带的亮度应大体一致;

(2)纯化模板或者使用试剂盒提取模板DNA或加大模板的用量

(3)更换Buffer或调整浓度

(4)重新设计引物(避免链间二聚体和链内二级结构)或者换一管新引物;

(5)降低退火温度、延长延伸时间。


3、非特异性扩增带 

原因:引物与靶序列不完全互补,引物有二聚体;退火温度过低,PCR循环次数过多;模板或引物浓度过高;Mg2+浓度偏高。

方案:

(1)降低引物量,适当增加模板量,减少循环次数;

(2)降低镁离子浓度;

(3)适当提高退火温度或使用二阶段温度法;

(4)减少循环次数。


4、拖尾—产物在凝胶上呈Smear状态

原因:模板不纯;Buffer不合适;退火温度偏低;dNTP、Mg 2+浓度偏高;循环次数过多

方案:

(1)纯化模板

(2)更换Buffer

(3)适当提高退火温度

(4)适当降低dNTP和镁离子的浓度

(5)减少循环次数


5、带大小与预期理论值不一致

原因:污染问题;模板或引物使用不当;基因的不同亚型。

方案:

(1)实验中的污染可能会干扰PCR产物的大小。为了避免这种情况,应使用全新的试剂和枪头,并彻底清洁实验工作台,确保实验环境的洁净;

(2)重新选择并使用正确的引物和模板DNA;

(3)遗传多样性可能导致目标基因存在不同的亚型,这些亚型在序列上的差异可能会影响PCR产物的大小。对目标基因进行详细的序列分析和使用BLAST等生物信息学工具进行相似性搜索,可以帮助识别并考虑这些基因亚型的影响。





本文作者是"远方"同学,在获得授权后,实验老司机将本文发表于公众号。

文稿:远方 

校对:煲仔饭

素材:

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