一、什么是冰冻切片？
冰冻切片是一种直接将组织在低温下迅速冻结达到一定硬度后进行切片的技术。
二、为什么要进行冰冻切片？
组织未经过固定、脱水、透明、包埋的实验过程，组织不会收缩变形，真实的保存细胞原有状态，快速、简便、已操作；组织未经任何处理，最大限度保存内部脂类、糖原、抗原等化学成分的活性，已广泛应用于临床病例检测与科学研究中。
三、冰冻切片及HE染色流程
1、组织取材：根据检测要求，切取相应组织，大小在0.2*1.5*1.5（单位：CM）。
2、速冻：取好的组织迅速置于软塑料管底或者锡箔纸制的小管底部，将管底接触液氮，10-20s后，待组织冻结成块，若无法立即切片，可以转移至-80℃冰箱保存。
3、包埋：冻结成块的组织先置于冰冻切片机中回温，在回温过程中，在组织托上滴加少量OCT，于冰冻切片机中微冻，调整组织块方向，使需要切片一侧背对样品托粘于OCT上，同时加入适量OCT使组织包裹在其中，立即置于冰冻切片机中冷冻成块。
4、控温：根据需切片的组织设置合适的温度，温度过高过低均无法获得完好的切片。
5、切片：调整切片刀与防卷板的角度至0°~1°，调整盖板前后距离适中，根据待切组织要求调整切片厚度在 4-20 μm之间。防卷板保持清洁，轻微调整，保证切片在刀与防卷板之间通过。切好的片子用常温载玻片从一侧粘片，顺势提起粘附切片。
6、固定：冰冻切片复水后应立即进行固定，抑制或破坏组织内酶活性、沉淀蛋白，防止组织自溶降解，保持组织细胞与正常生活时的形态相似。一般采用乙醇：乙醚1:1溶液进行固定，时间30s左右。
7、HE染色及镜检：固定好的切片置于苏木素染色10 min，水洗干净，1%盐酸乙醇分化10 s，水洗干净，温水返蓝20 s，伊红染色2 min，水洗干净， 90% 、95% 、100%乙醇各3min，二甲苯透明后中性树胶封固，显微镜下观察拍照。
图片引自“必应cn.bing.com”
四、注意事项
1、组织取材要保证新鲜，若表面有污染物，切记不要用生理盐水或双蒸水清洗，可以用滤纸擦拭干净，否则易产生冰晶；组织取材要快速，否则易造成组织降解。
2、取材后的组织要迅速冻结成块，一般采用液氮快速降温速冻的方式。若需要固定的组织可以使用4%多聚甲醛固定后，于30%蔗糖溶液中浸泡至沉底，替换组织中的水分，防止冰晶损伤；较小的组织可以在速冻的时候加入少量的OCT包裹。
3、根据组织的特性，在切片之前2h设置切片机的温度，保证切片时温度控制稳定。一般情况下，冰冻切片机全天处于备用状态，箱体温度控制在-20~-25℃，冷台温度在-30~-40℃。通常对于细胞致密的组织，温度需要控制在-18~-22℃；细胞稀疏的组织，温度需要控制在-22~-26℃。
4、切片时要保证刀头、刀架拧紧，样品头固定，刀角调整至4-6°；先用旧到修片，切至合适的位置后改换新刀；进刀速度要慢且稳。
5、粘片的载玻片要常温存放，表面可以用多聚赖氨酸涂片防脱。利用温差将切片粘于载玻片上后于切片盒中保存，防止污染。
本文作者是"花筱福"同学，在获得授权后，实验老司机将本文发表于公众号。
文稿：花筱福
校对：煲仔饭
参考资料：
https://blog.catkin.moe/2019/10/22/冰冻切片机操作流程/
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