流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）软件的使用过程中，设置门（gate）和控制边界是数据分析的关键步骤。门设定用于从大量细胞数据中选择感兴趣的细胞群体，而控制边界可以帮助区分阳性和阴性群体。以下是一些核心知识，帮助理解如何有效地确定门和控制边界。
一、确定门的原则
在流式细胞术中，"门"是指一个设定的参数范围，常见门的类型有矩形门、多边形门、十字门以及圆形和椭圆门。总体来说，不同类型的门都是用来选择和分析特定细胞群体。在这个过程中，"门"就像一个过滤器，能够排除不相关的细胞或噪音，使用“门”圈出需要研究的群体并作进一步的研究。
设定"门"通常依据：
1、前向散射（FSC）与侧向散射（SSC）：FSC反映细胞的大小，SSC反映细胞的复杂性或颗粒性。根据FSC和SSC的图，研究人员可以通过FSC与SSC光信号分群特征设定不同的门来区分不同类型的细胞（如淋巴细胞、单核细胞等）。
如图[1]所示，人PBMC内单核细胞与淋巴细胞具有不同的光信号分群特征，可根据此特征设定多种不同形状的门来区分不同类型的细胞，并进一步研究“门”所圈出的细胞。
2、荧光强度：不同细胞标志物通过荧光染料标记，研究人员可以在荧光图上设定门来识别表达特定标志物的细胞群。
如图[2]所示，研究人员通过分别标记不同荧光的CD4与CD8抗体，流式细胞术将不同细胞群展示在研究人员眼前，研究人员可以使用门圈出自己感兴趣的细胞如CD4+CD8+dp细胞进一步研究。
3、多参数设定：通过多个参数同时设定门，例如结合FSC、SSC 和荧光信号，精确区分不同类型的细胞群体。
4、使用对照样本：适当的对照样本（如阴性对照和同型对照）对于确定正确的门位置至关重要，可帮助识别背景荧光和非特异性信号。
二、确定控制边界
控制边界的设定主要用于区分阳性和阴性信号，尤其是荧光染色时的荧光信号强度。设定控制边界时可以参考以下几个关键点：
1、阴性对照：阴性对照是没有特异性染色的样本，用于确定非特异性荧光信号的背景水平。在直方图中，阴性对照通常帮助设定阴性信号的边界，任何高于该背景的信号可以被视为阳性。
如上图所示，研究人员使用没有特异性染色的细胞上机检测，直方图显示该荧光的背景信号值为103，高于103的信号值可以被视为阳性。
2、阳性对照：阳性对照含有已知阳性标记的细胞或染色，用于确定阳性信号峰的位置，并帮助划定阳性和阴性细胞的分界线。
如上图所示，研究人员使用处理过的阳性细胞上机检测，直方图显示该荧光的最低信号值约为103，低于103的信号值的细胞可以被视为阴性细胞。
3、同型对照（Isotype Control）：同型对照是与目标抗体具有相同IgG亚型的非特异性抗体，用来校正非特异性结合。通过观察同型对照的荧光信号强度，判断特异性结合和非特异性结合的界限。
注意：同型对照抗体需选择与一抗相同种属来源、相同亚型的免疫球蛋白，并且与荧光素、F/P值（荧光素/抗体）保持一致。因此，流式实验中建议选用同一厂家、品牌的一抗和同型对照抗体，因为不同品牌抗体的F/P值会存在差异。
本文作者是"大鹏"同学，在获得授权后，实验老司机将本文发表于公众号。
本文由作者根据自身经验总结而成，内容仅供参考。
文稿：大鹏
校对：煲仔饭
参考资料：
[1] Johnson, R.K., Overlee, B.L., Sagen, J.A. et al. Peripheral blood mononuclear cell phenotype and function are maintained after overnight shipping of whole blood. Sci Rep 12, 19920 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-24550-6
[2] Rabiger FV, Bismarck D, Protschka M, et al. Canine tissue-associated CD4+CD8α+ double-positive T cells are an activated T cell subpopulation with heterogeneous functional potential.PLoS One. 2019 Mar 13;14(3):e0213597. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0213597
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