CRISPR-Cas9，全称是成簇规律间隔的短回文重复序列及其相关蛋白9，尽管这听起来有点拗口，但它毫无疑问是21世纪生物技术研究史上的一座里程碑。从最初在细菌中发现CRISPR序列，到科学家们逐步揭示其工作原理，再到将其成功应用于基因编辑，这一过程充满了曲折和挑战。CRISPR-Cas9这把“基因魔剪”的出现，为我们开启了一扇通往基因编辑的大门。
（图片来源：https://bossbetty.com/wp-content/uploads/2020/10/Jennifer-Doudna-and-Emmanuelle-Charpentier）
从细菌免疫系统到“基因魔剪”
CRISPR-Cas9的故事要从细菌免疫说起。早在1987年，日本科学家石野良纯在研究大肠杆菌的碱性磷酸酶同工酶基因组时，发现终止密码子后的非编码区存在一些异常重复序列，这些序列被命名为CRISPR（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats，成簇规律间隔的短回文重复序列）。
（图片来源：https://www.nature.shu.edu.cn/CN/Y2016/V38/I4/278）
起初，科学家们并不知道这些重复序列到底有什么作用。直至2005年，CRISPR的研究才迎来一个历史性的转折。
2005年，几乎在同一时间，来自西班牙和法国的三个研究小组报告了一项重大发现：通过对CRISPR居间序列的深入分析，他们意外地发现这些序列并非源自细菌本身，而是来自病毒或质粒。这一发现引出了一个重要问题：细菌获取这些序列的目的是为了什么？
美国国立生物技术信息中心(NCBI)进化生物学家库宁（Eugene Koonin），提出了他的猜想：CRISPR序列与细菌的免疫系统有关。这些重复序列中的间隔序列与入侵的病毒或质粒的DNA序列高度相似，细菌会将入侵的病毒的DNA片段“记录”下来，形成CRISPR序列。而当同样的病毒再次入侵时，细菌就可以根据这些“记忆”来识别并消灭病毒，这就类似于人体的免疫系统。
（图片来源：https://innovativegenomics.org/wp-content/uploads/2021/07/2.3A-Where-Does-CRISPR-Come-From-1-768x342.png）
这一猜想激发了法国微生物学家巴兰古（Rodolphe Barrangou）的浓厚兴趣。巴兰古在一家酸奶生产公司担任微生物学家。他的日常工作充满挑战，生产酸奶的关键菌株——嗜热链球菌频繁遭受噬菌体攻击的问题让他十分头疼。噬菌体能够导致细菌大量死亡，严重影响了酸奶的质量和产量。
而库宁提出的猜想，正好为巴兰古在噬菌体防控上提供一种新的解决思路——通过操纵CRISPR-Cas系统，增强细菌对噬菌体的抵抗力。他意识到，如果能够验证并应用这一猜想，将极大提升酸奶生产的稳定性和效率，减少噬菌体感染带来的损失。
于是，巴古兰使用两种噬菌体（P1和P2）攻击链球菌。大多数细菌被消灭，但有些细菌幸存下来，并且对噬菌体产生了抵抗力。研究发现，这些有抵抗力的细菌的CRISPR序列中包含了噬菌体的DNA。如果CRISPR序列中有P1的DNA，细菌就能抵抗P1；有P2的DNA，就能抵抗P2；如果包含两种噬菌体共有的DNA，就能抵抗两者。这一实验首次证实了CRISPR-Cas9是一种细菌的获得性免疫系统。
（图片来源：https://innovativegenomics.org/wp-content/uploads/2021/07/2.3B-Where-Does-CRISPR-Come-From-300x276@2x.png）
2008年，荷兰科学家John van der Oost团队发现，小RNA分子（crRNA）在大肠杆菌抗病毒反应中起关键作用，帮助识别和摧毁病毒。他们首次通过人为设计了相应的crRNA序列，使细菌获得抵抗噬菌体的能力，这是人类首次编辑CRISPR系统，为基因编辑技术的发展奠定了基础。
诺奖级发现：CRISPR-Cas9的潜力
2010年，科学家们已经对CRISPR-Cas系统的基本生物学功能和分子机制有了较为深入的理解，并初步将其应用于细菌噬菌体感染的防控和细菌进化分析等领域。然而，由于当时已研究的Ⅰ型和Ⅲ型CRISPR-Cas系统结构复杂，限制了其应用范围。
2011年3月，法国的微生物学家埃马纽埃尔·夏彭蒂耶（Emmanuelle Charpentier）在化脓链球菌发现多种非编码RNA，特别是一类在CRISPR序列附近的新型小RNA，将其命名为反式激活CRISPR来源RNA( tracrRNA)。在化脓链球菌中，tracrRNA对于病毒的失活至关重要。它与crRNA形成双链结构，引导Cas9蛋白（当时称为Csn1蛋白）到达目标位置。
（图片来源：https://www.nature.shu.edu.cn/CN/Y2016/V38/I4/278）
2011年，在波多黎各的一次微生物会议上，夏彭蒂耶与美国加州大学伯克利分校的结构生物学家詹妮弗·杜德纳（Jennifer Anne Doudna）相遇。
当时，杜德纳专门成立了一个细菌CRISPR-Cas系统的青年研究小组，并且她对这种简单的Ⅱ型系统特别是tracrRNA很着迷，而夏彭蒂耶则对Cas9作用机制更感兴趣。两人一拍即合，非常愉快地达成了合作。
2012年6月28日，两位科学家在《Science》杂志上发表了一篇重要论文。他们通过体外试验取得了对CRISPR-Cas9系统研究的突破性发现：crRNA能够与tracrRNA通过碱基互补配对形成特殊的双链RNA结构，这一结构能够精确地指导Cas9酶在靶标DNA上引起双链断裂。
（图片来源：https://img1.dxycdn.com/2021/1222/537/8450583922912022253-14.png）
这一发现不仅揭示了CRISPR-Cas9系统的工作原理，还为基因编辑技术的发展提供了新的思路。为了进一步提高CRISPR-Cas9系统的易用性和效率，两位科学家们还进行了创新性的改造。她们将原本需要两条RNA（crRNA和tracrRNA）的系统，融合改造成了一条更加易用的单链向导RNA（single-guide RNA, sgRNA）。这一改造大大简化了CRISPR-Cas9系统的操作，并证明了人工设计的向导RNA同样可以精确地指导Cas9蛋白切割任意指定的DNA序列。
这一研究成果的发表，标志着CRISPR-Cas9基因编辑技术正式进入了一个全新的发展阶段。它不仅为科学家们提供了一种高效、精确的基因编辑工具，还为生物学、医学等领域的研究带来了革命性的变革。Jennifer Doudna和Emmanuelle Charpentier两位科学家也因此被授予2020年诺贝尔化学奖。
（图片来源：nobelprize.org）
参考文献：
【1】GUO Xiaoqiang. The invention of CRISPR-Cas9 technology: 25-years scientific journey[J]. Chinese Journal of Nature, 2016, 38(4): 278-286.
【2】https://invitrogen.bioon.com.cn/article/b04f271721ca
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