在细胞研究中，通常需要对细胞的各个组份加以探究。其中，对细胞核蛋白和细胞浆蛋白进行分离，既能够为研究蛋白在细胞内的位置提供帮助，也常常使得分离得到的核蛋白在转录调控研究中发挥作用。
以匀浆器研磨法提取贴壁细胞核蛋白为例：
一、准备试剂
1、台盼蓝染液：取台盼蓝粉剂，将其溶解在10mL的双蒸水当中配制成质量体积比为4%（4%w/v）的台盼蓝母液。在使用时，利用PBS缓冲液将母液稀释10倍，使其浓度达到0.4%，之后再与细胞悬液混合均匀。
2、BufferA：包含10mmol/L的HEPES（在4℃下pH值为7.9）、1.5mmol/L的氯化镁、10 mmol/L的氯化钾、0.5mmol/L的二硫苏糖醇（DTT）。若担心浆蛋白降解会对核蛋白产生影响，可以添加1mmol/L的苯甲基磺酰氟（PMSF）。
3、BufferB：含有20mmol/L的HEPES（pH值为7.9）、体积分数为25%的甘油、0.42mol/L的氯化钠、1.5mmol/L的氯化镁、0.2mmol/L的乙二胺四乙酸（EDTA）、0.5mmol/L的苯甲基磺酰氟（PMSF）、0.5mmol/L的二硫苏糖醇（DTT）。
二、实验步骤
1、使用胰酶将贴壁细胞消化下来，把这些细胞收集到1.5mL EP管中。4℃以300g的离心力离心5min。离心完成后，用PBS缓冲液对细胞进行洗涤(2次)。
2、弃上清，加入体积为细胞沉淀5倍的预冷Buffer A（每20μL的细胞沉淀加入100μL的Buffer A），之后轻轻吹打，使细胞在Buffer A中重新悬浮起来。
3、将上述细胞悬浮液在冰上放置10min，随后再次在4℃条件下，以300g的离心力离心5min。离心结束后，加入体积为其25倍的预冷Buffer A，并通过吹打操作让细胞重新悬浮。
4、把经过上述处理后的细胞悬液转移匀浆器中，准备进行匀浆操作。
5、在匀浆过程中，取出少量的细胞悬液，与等体积的0.4%台盼蓝染液混合均匀，接着在显微镜下观察细胞的破膜情况。如果观察到大部分细胞都被染成了蓝色，就停止匀浆操作；要是大部分细胞未被染成蓝色，则继续进行匀浆。
6、当大部分细胞的细胞膜被破坏后，将细胞悬液转移至Eppendorf管中，然后在4℃环境下，以25000g的离心力离心20min。
7、离心完成后，此时上清液中包含的是细胞裂解物中的胞浆成分，而沉淀部分则是核蛋白。
8、收集离心后的沉淀，向其中加入与沉淀等体积的预冷Buffer B，然后轻轻地吹打，使沉淀呈现悬浮状态。接着将悬浮液转移到干净的组织匀浆器中，以均匀的力度进行30次匀浆操作。
9、把经过匀浆的悬浮液转移到Eppendorf管中，放在冰上的低速摇床上振荡45min。
10、在4℃条件下，以25000g的离心力离心30min，收集得到的上清液即为细胞核蛋白
11、提取核蛋白后，可使用一些核蛋白（如H3蛋白、Lamin蛋白）作为对照蛋白，进行WB验证。
内源性circ-sirt1的敲除增强了TNF-α诱导的NF-κBp65核转位
三、注意事项
1、全部步骤均需于冰上操作。
2、第七步操作切勿触碰沉淀，可于沉淀上方留存极少量上清液，该上清液即为抽提所得的细胞浆蛋，不然会造成细胞浆蛋白的污染状况。
本文作者是"小米"同学，在获得授权后，实验老司机将本文发表于公众号。
本文由作者根据自身经验总结而成，内容仅供参考。
文稿：小米
校对：煲仔饭
素材：
Kong P, Yu Y, Wang L, Dou YQ, Zhang XH, Cui Y, Wang HY, Yong YT, Liu YB, Hu HJ, Cui W, Sun SG, Li BH, Zhang F, Han M. circ-Sirt1 controls NF-κB activation via sequence-specific interaction and enhancement of SIRT1 expression by binding to miR-132/212 in vascular smooth muscle cells. Nucleic Acids Res. 2019 Apr 23;47(7):3580-3593. doi: 10.1093/nar/gkz141. PMID: 30820544; PMCID: PMC6468289.
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