小鼠淋巴细胞是其免疫系统的关键组成部分，主要包括T细胞、B细胞和自然杀伤细胞（NK细胞）。T细胞分为辅助性T细胞（CD4+）和细胞毒性T细胞（CD8+），分别在调节免疫反应和直接杀伤感染细胞中发挥作用。B细胞负责产生抗体和抗原呈递，而NK细胞则通过识别和消灭异常细胞快速响应感染和肿瘤。这些淋巴细胞广泛分布在小鼠的脾脏、淋巴结、胸腺和骨髓等组织中，是免疫学研究的主要模型，有助于理解人类的免疫机制。
脾脏作为重要的免疫器官之一，含有丰富的淋巴细胞，占全身淋巴组织的25%。由于小鼠的血液量较少，从外周血中难以分离出足够的淋巴细胞，因此通常需要从小鼠的脾脏中获取大量的淋巴细胞。
一、实验步骤
1、准备材料和试剂
选择成年小鼠，确保其具有正常的免疫功能。断颈处死小鼠，并将小鼠尸体浸泡在75%酒精中进行消毒处理。准备已消毒的眼科剪刀和镊子，无菌6cm培养皿、冰PBS。
2、处理小鼠脾脏
用剪刀和镊子取出小鼠的脾脏，置于含有冰冷PBS的培养皿中。将脾脏放在70微米细胞筛网上。使用5 ml注射器的活塞在筛网上轻轻研磨脾脏，逐步加少量冰PBS，直至脾脏完全被研磨成细胞悬液。将通过筛网的细胞悬液收集到15 ml离心管中。
3、离心
1）在一个15 mL的离心管中，首先加入5 mL的Ficoll分离液。然后将管子倾斜，轻轻地将含有淋巴细胞的PBS缓慢倒入Ficoll分离液中。此时，会观察到明显的液体分层现象。
2）接下来，以600 rpm的速度进行梯度离心25分钟，升速和降速均设置为2。离心结束后，液体将分成三层。随后，小心地吸取中间层的液体（其中含有淋巴细胞和少量红细胞），转移到一个新的15 mL离心管中，并补充PBS，再次以600 rpm离心5分钟。
3）离心后，弃上清，加入1~2 mL的红细胞裂解液，在冰上处理5分钟。最后，再补充PBS，以600 rpm离心5分钟。
4）弃上清, 可见白色沉淀，此时沉淀为总淋巴细胞。
二、注意事项
1) 使用Ficoll溶液进行离心分层后，血液成分会按密度梯度重新排列。血浆和血小板由于密度较低，会浮在分层液的上部；PBMC（外周血单个核细胞）的密度稍低于Ficoll溶液，因此在界面处形成一层白膜；而红细胞和粒细胞因密度较高，会沉积在分层液的底部。
离心结束后，从管底往上依次是红细胞、粒细胞、Ficoll细胞分离液、淋巴细胞、血小板和血浆。在提取淋巴细胞时，需要小心地移除上层的血浆和血小板，然后再吸取位于界面处的淋巴细胞层。
2) 梯度离心时要小心吸取中间层的细胞悬液，尽量避免吸入上层和下层的液体。
3）加入红细胞裂解液后，应在冰上处理5分钟，以提高裂解效果并保持细胞活性。处理结束后立即补充PBS并进行离心，以去除裂解后的红细胞残渣。
4) 上述所有步骤都必须在无菌环境中进行，使用无菌试剂和耗材。
本文作者是"小米"同学，在获得授权后，实验老司机将本文发表于公众号。
文稿：小米
校对：煲仔饭
参考资料：
https://cell.ucallm.com/c02/327
https://images.app.goo.gl/AzoPEjAmmdDNijCw6
https://images.app.goo.gl/JZw4gmqJGZTdbL1A7
Shi W, Wang Y, Zhang C, Jin H, Zeng Z, Wei L, Tian Y, Zhang D, Sun G. Isolation and purification of immune cells from the liver. Int Immunopharmacol. 2020 Aug;85:106632. doi: 10.1016/j.intimp.2020.106632. Epub 2020 May 27. Erratum in: Int Immunopharmacol. 2023 Jun;119:110156. doi: 10.1016/j.intimp.2023.110156. PMID: 32470880.
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