细胞共培养（co-culture）是将两种或多种不同类型的细胞同时培养在同一系统中，使它们在共享的环境中进行相互作用。这种技术用于模拟体内的细胞微环境，研究不同细胞之间的相互作用及其对生物学过程（如信号传导、细胞生长、分化等）的影响。
一、共培养方式
1.直接共培养：
定义：将两种或多种细胞直接种植在同一培养皿或培养板中。常用于研究细胞之间的直接接触及其影响，如免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤效应。通常用于培养间接与下室细胞相互作用的细胞，或某种需要检测的细胞类型。上室与下室通过多孔膜隔开，该膜可以允许小分子或分泌因子通过，但不允许细胞直接接触。
✅ 上室：研究者可以将不同类型的细胞（如免疫细胞、上皮细胞等）放置在上室，以便检测其分泌的因子对下室中细胞的影响。
✅ 下室：下室一般用于培养另一种细胞类型或实验中主要研究的细胞。这些细胞可能会受到来自上室的分泌因子或信号的影响，因此可通过分析下室细胞的反应来研究细胞间的相互作用。
优点：直接观察细胞间的相互作用。
缺点：可能导致细胞混杂，难以分离后续分析。
2.Transwell共培养：
定义：使用Transwell系统将不同的细胞分隔在不同的层次中。上层细胞放在多孔膜的Transwell插入物中，下层细胞则在底部培养皿中。广泛用于研究细胞间的分泌因子和信号传导（如肿瘤细胞与成纤维细胞之间的相互作用）。
优点：通过分泌的信号分子进行相互作用，避免了细胞之间的直接接触，方便后续分离和分析。
缺点：无法模拟直接接触的细胞间相互作用。
3.3D共培养：
定义：将细胞种植在三维支架或基质中，使其在三维环境中生长和相互作用。用于更接近体内的细胞微环境，研究细胞在三维空间中的生长、分化和相互作用。
优点：更好地模拟组织中的细胞结构和功能。
缺点：技术复杂，成本较高。
4.条件培养基共培养：
定义：将一种细胞的培养基收集，经过处理后用于另一种细胞的培养，以研究细胞分泌的因子对另一种细胞的影响。
优点：简单，易操作。
缺点：无法模拟直接接触或更复杂的细胞间相互作用。
二、transwell共培养步骤
下面我们将以transwell共培养为例，详细阐述肿瘤细胞和成纤维细胞的共培养的具体实验步骤。
1.材料准备：
（1）细胞类型：选择要共培养的肿瘤细胞和成纤维细胞系NIH 3T3。
（2）Transwell插入物：通常使用孔径为0.4 µm的Transwell插入物，以确保细胞之间只能通过分泌的因子交流，而不会直接接触。（一般的迁移、侵袭实验的孔径为8µm）
（3）培养基：选择合适的培养基，确保两种细胞都能生长。提前更换两种细胞都能生长的培养基。
2.成纤维细胞接种：
（1）取细胞汇合度70-80%的成纤维细胞，消化、离心、重悬后计数
（2）将成纤维细胞接种在Transwell的下层板（通常为6孔板或24孔板），为了观察成纤维细胞在肿瘤细胞细胞的共同培养下发生的变化，我们把主要观察的成纤维细胞铺在下室，方便后续的细胞收集。（通过收集下室的细胞，可以直接检测上室细胞的分泌物或信号对下室细胞的影响，比如细胞的增殖、凋亡、分化等变化。有助于研究细胞间的相互作用和影响。）
（3）铺板密度根据细胞增值情况而定。本次实验选择6孔板，每孔铺4×10⁵个NIH 3T3细胞覆盖底部。
（4）培养4小时，等待成纤维细胞贴壁后铺肿瘤细胞。
3.肿瘤细胞接种：
（1）取细胞汇合度70-80%的肿瘤细胞消化、离心、重悬后计数
（2）将肿瘤细胞接种在Transwell的上层隔膜上。在小室上方垂直悬空、匀速滴入肿瘤细胞悬液
（3）铺板密度密度根据实验需要进行调整（通常为5×104到2×105个细胞/插入物）。
4.共培养：
将共培养体系放入37°C、5% CO₂的培养箱中培养。培养时间根据实验目的选择。第一次实验可设置时间梯度例如24小时、48小时或更长时间。
5.实验终点及分析：
共培养后的细胞可用于细胞增殖、迁移、侵袭实验，检测细胞形态、分泌因子的变化，也可以提取RNA、蛋白质观察一系列变化等。
三、注意事项
1.细胞比例和密度：不同细胞系可能需要调整种植密度，确保实验数据具有可重复性。
2.Transwell的孔径选择：一般使用0.4 µm孔径，防止细胞穿过隔膜。
3.培养时间：根据实验的需要设定共培养时间，短时间的共培养可以评估信号传递，长时间共培养可能影响细胞增殖和分泌功能。
通过Transwell共培养方法，可以深入研究细胞之间的信号传递及肿瘤微环境的复杂互动。赶快去试一下吧！
本文作者是"林林"同学，在获得授权后，实验老司机将本文发表于公众号。
本文由作者根据自身经验总结而成，内容仅供参考。
文稿：林林
校对：煲仔饭
素材：
Lim, Yeong-Hwan & Kim, Young-Kook. (2023). Roles of non-coding RNAs in intercellular crosstalk in cardiovascular diseases. The Korean journal of physiology & pharmacology : official journal of the Korean Physiological Society and the Korean Society of Pharmacology. 27. 289-298. 10.4196/kjpp.2023.27.4.289.
https://doi.org/10.1016/j.tibtech.2022.07.014.
https://images.app.goo.gl/npHrUm1nLvsJaD3t9
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