【First-in-class药设系列】靶向GSPT1的分子胶设计及在抗胶质母细胞瘤中研究

健康 2024-12-10 18:16 上海

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胶质母细胞瘤（Glioblastoma, GBM）是成人中最具侵袭性的原发性恶性脑肿瘤,其治疗方法主要包括手术、放疗，靶向治疗，免疫治疗和干细胞治疗等。由于GBM存在高度的异质性，通常有低的突变负担，并且其肿瘤微环境固有的免疫抑制性，使得传统的化疗和免疫疗法难以发挥预期效果。mTOR是雷帕霉素靶蛋白，其通过PI3K-AKT-mTOR信号通路或通过影响胶质母细胞瘤微环境在胶质母细胞瘤的发展中起着至关重要的作用。GSPT1作为调控蛋白翻译终止的关键蛋白，在胶质母细胞瘤中高度表达，并通过特定机制促进胶质母细胞瘤的进展。有研究表明，mTOR抑制剂耐药原因之一可能是由于GSK3β表达量降低引起，而GSPT1的降解会促使GSK3β的表达上调，有望克服其耐药。与此同时，mTOR的抑制能有效增强GSPT1降解剂活性，并且mTOR抑制和GSPT1降解在细胞翻译的始末具有协同作用。基于此，研究人员提出了一种利用分子胶技术将小分子抑制剂和分子胶降解剂特性整合到单一分子中的新策略。

首先，通过结合多种mTOR抑制剂和E3泛素连接酶配体，结合分子胶的特点，研究人员选择刚性短的连接体构建双功能化合物库，通过多轮筛选，筛选出YB-2-43，它对胶质母细胞瘤细胞的增殖具有抑制作用。通过进一步的结构优化，最终获得mTOR抑制和GSPT1降解活性更好的双功能化合物YB-3-17。同时使用MLN0128（mTOR抑制剂）和SJ6986（GSPT1降解剂）治疗U87细胞，发现其抗肿瘤活性虽有提高，但仍逊于YB-3-17，这表明YB-3-17在同时干扰两个靶点时存在显著协同作用。

基于torkinib与mTOR的共晶结构(PDB:4JT5)，研究人员使用mTOR对YB-3−17和MLN0128进行了分子动力学模拟，对接结果表明YB-3-17能够有效适应mTOR的激酶口袋，其琥珀酰亚胺环中的羰基基团与mTOR的LYS2306形成了强烈的氢键相互作用，这可能增强了其抑制活性。MMGBSA分析显示，YB-3-17与mTOR的亲和力较低，表明与MLN0128相比，YB-3−17是一个更稳定的配合物。此外，使用CRBN-CC885GSPT1的共晶结构(PDB:SHXB)，预测了YB-3-17的分子胶结合模式。

将YB-3-17中的谷氨酰胺进行乙基化以得到YB-3-17-NEG，作为阴性对照组；其丧失了与CRBN的结合，并且降低对GSPT1的降解活性，但保留了较强的对下游mTOR磷酸化的抑制。经免疫共沉淀实验显示，在YB-3-17处理下，Flag-CRBN HeLa细胞中的GSPT1蛋白与mTOR相比显著富集，而MLN0128和阴性对照分子YB-3-17-NEG则没有达到这种效果，这些结果突出表明YB-3−17独特的作用机制，其选择性地增强GSPT1在目标细胞环境中的积累，并诱导CRBN和GSPT1之间形成紧密的次级复合体。

研究人员对YB-3-17进行了进一步的生物学活性评估以及机制验证。YB-3-17以浓度和时间依赖性的方式显著抑制了U87细胞中S6K，4EBP1以及AKT蛋白的磷酸化水平，表明其抑制mTORC1/2复合物活性的能力。YB-3−17处理细胞6h可以观察到GSPT1明显降解。随后，研究发现，YB-3-17诱导的GSPT1降解可以被蛋白酶体抑制剂(卡非佐米、硼替佐米)、类泛素化抑制剂(MLN4924、MLN7243)和泊马度胺阻断，但不会被MLN0128阻断，这表明GSPT1的降解依赖于蛋白酶体系统而不是与mTOR的结合。

这表明了YB-3-17通过蛋白酶体途径作用于GSPT1的特异性。激酶活性测定表明，YB-3-17的ICs0为0.22nM，优于mTOR抑制剂MLN0128。在生物学活性评估中，YB-3-17还展现出了对多种神经肿瘤细胞的增殖抑制作用，显著优于单靶点mTOR抑制剂、GSPT1降解剂以及它们的联合治疗。这一结果充分展示了YB-3-17通过双靶点协同作用所带来的治疗优势。相比单一靶点药物，YB-3-17能够同时作用于mTOR和GSPT1，可以更有效的抑制肿瘤细胞增殖。

进一步，通过蛋白质组学和激酶谱实验评估YB-3-17的降解选择性和激酶抑制选择性，以此来评估其安全性。蛋白质组学分析显示，YB-3−17处理后GSPT1，GSPT2和SNUPN均有下调，但通过western blotting验证表明，YB-3−17并没有诱导GSPT2和SNUPN这两种蛋白的降解，这表明YB-3−17只显著降解GSPT1，而不影响其他细胞内蛋白，展现极好的降解选择性。同时，激酶谱实验显示，不同于MLN0128，YB-3−17不抑制对细胞生长至关重要的FGR、CSF1R （FMS）、LCK和LYNa等脱靶蛋白，进一步证实，YB-3-17在抑制mTOR活性时具有显著的选择性，未对多种常见的细胞生长相关激酶产生抑制作用。同时，在对小鼠进行的为期三天的连续给药研究中，MLN0128单次30 mg/kg剂量会导致小鼠死亡，而接受等量YB-3−17治疗的小鼠在整个研究期间保持良好的健康状况。这些数据表明，YB-3−17降低了脱靶效应的毒性，同时通过降解GSPT1和抑制mTOR增强了疗效。

通过RNA测序分析，作者进一步探索YB-3-17的作用机制。KEGG分析显示，YB-3−17显著富集了与多种途径相关的基因，包括氨基酸合成、内质网蛋白质加工和胰岛素抵抗信号。这种广泛的活性表明YB-3-17对细胞过程的多方面影响。且通过火山图分析，YB-3-17处理后SENS2、DDIT4和CHAC1在mRNA水平上的显著上调，这些基因能够显著增强对mTOR的抑制活性。同时，YB-3−17还显示出大量富集与细胞凋亡（DDIT3）和p53信号通路（GADD45A）相关的基因。以上数据表明，YB-3-17通过影响更广泛的信号通路发挥抗肿瘤效应。

在体内实验中，通过将U87细胞接种到雄裸鼠中建立了异种移植模型，随后，通过腹腔注射对小鼠进行治疗。与对照组相比，MLN0128和YB-3−17均能显著抑制肿瘤生长。然而，在相同剂量下，YB-3−17表现出更好的疗效。在10/20 mg/kg剂量下，YB-3−17几乎完全停止肿瘤生长，导致肿瘤消退，表明其体内抗肿瘤能力更强。并且，相比于MLN0128，不同剂量的YB-3-17处理小鼠后，小鼠状态良好。进一步在体内验证了YB-3−17抑制mTOR和降解GSPT1的能力。通过免疫印迹法分析腹腔注射指定剂量的YB-3−17,MLN0128后，裸鼠肿瘤细胞中GSPT1、cyclin D1、pS6K、pAKT和β-actin的变化，进一步证实了YB-3-17显著抑制mTOR下游蛋白的磷酸化，并以剂量依赖性方式降解GSPT1。

综上，本研究提出了在一个小分子中同时实现mTOR抑制和GSPT1降解的双靶双机制小分子设计策略，通过多轮筛选以及结构优化，设计开发出小分子YB-3-17，其表现出优于mTOR抑制剂MLN0128的肿瘤抑制活性、选择性和安全性。该化合物验证了双靶点、双机制策略的可行性，为抗肿瘤药物开发提供了新的治疗思路。

参考文献

Yongbo Liu, Xiuyun Sun, Qianlong Liu, Chi Han, Yu Rao. A Dual-Target and Dual-Mechanism Design Strategy by Combining Inhibition and Degradation Together. J Am Chem Soc. 2024 Dec 2. doi: 10.1021/jacs.4c11930

封面图来源：pixabay

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