作者I 方静纯，徐鸿绪
单位I 中山大学附属第一医院南沙院区医学检验科
隐球菌病(Cryptococcosis)是由隐球菌引起播散性感染性疾病，主要引起肺炎和脑膜炎，也可引起皮肤、骨骼或内脏器官感染。该疾病常见于免疫力低下的患者，如艾滋病患者、长期使用免疫抑制剂的人群等。
但是，近年来随着CT的普及和检验方法的完善，免疫功能正常宿主的检出率明显升高。本文分享一例耶氏肺孢子菌肺炎合并隐球菌肺炎、隐球菌脑膜炎诊疗过程。
患者男，52岁，7月余前无明显诱因反复出现腹泻，每天大便3-4次，为黄色稀水样便，大多位于早上，便前便后无腹痛，无里急后重感，无发热，无盗汗，无头痛、头晕，无恶心、呕吐，无胸闷、气促，无反酸、烧心等不适。现患者为进一步诊治于5月8号就诊我科。
入院检查：C反应蛋白CRP 1.23mg/L ，白细胞WBC 11.02x10^9/L ↑，中性分叶粒细胞NEUT% 0.833 ↑，血红蛋白Hb 134g/L ，血小板PLT 158x10^9/L ；降钙素原PCT：0.04 ng/mL；红细胞沉降率(ESR,毛细管法) 86mm/h。
辅助检查：【10号胸部CT】1.右肺上叶尖段肿块及结节，考虑肺癌可能性大。2.双肺另见多发结节，性质待定，建议复查。3.双肺上叶炎症。【内镜标本活检】1.乙状结肠 息肉：增生性息肉。2. 直肠 息肉：可符合炎性息肉。
病情平稳期：
患者入院时体温正常，无咳嗽咳痰，5月15号胸部CT对比入院提示双肺炎症，较前稍进展，考虑患者存在肺部结节和肺部炎症进展，留取肺泡灌洗液培养、肺泡灌洗液曲霉菌检测、病原体宏基因组测序、病理学等检查。患者肺泡灌洗液培养涂片可见圆形孢子，偶见出芽孢子，疑似隐球菌，联系临床询问得知有养禽史。
图1 肺泡灌洗液原始标本涂片可见圆形孢子（左：革兰染色，右：荧光染色）
5月18号肺泡灌洗液NGS结果回报：新生隐球菌 阳性（序列数 68281），耶氏肺孢子菌 阳性（序列数 29134），考虑患者存在肺隐球菌感染及耶氏肺孢子菌感染，目前氟康唑200mL QD ivdrip抗隐球菌治疗，磺胺0.96g QID抗孢子菌治疗。
图2 肺泡灌洗液NGS结果
肺泡灌洗液培养5天挑取SDA平板上湿润、奶白色菌落调成菌悬液革兰染色和墨汁染色，最终经质谱鉴定为新型隐球菌。
图3 a为培养5天SDA平板的隐球菌，b菌液涂片革兰染色，c菌液墨汁染色
5月20号肺组织病理结果回报：肺泡间隔增宽，肺泡上皮轻度增生，未见明确恶性特征。特殊染色结果示个别真菌孢子样结构，结合NGS检测结果，可符合隐球菌感染改变。
图4 a为右肺上叶尖段活检物标本，b、c为特殊染色结果示个别真菌孢子样结构
病情恶化期:
5月20号患者出现头痛、头晕，以后颈为主，咳嗽时加重，无天旋地转感，出现发热，体温最高37.5℃。颅脑(MR)提示左侧小脑半球病灶，需注意转移瘤可能。为进一步明确病变，行腰穿送脑脊液常规、脑脊液生化、脑脊液隐球菌抗原检测及涂片找隐球菌。
脑脊液常规检查：白细胞计数WBC(CSF) 14.00×10^6/L ↑，单个核细胞(CSF) 0.71，多个核细胞(CSF) 0.30 ；脑脊液蛋白PROT 650.0mg/L ↑，葡萄糖(CSF)GLU 2.5mmol/L；脑脊液隐球菌抗原阳性；血清隐球菌抗原阳性。但脑脊液3500rpm离心10分钟取沉淀墨汁染色，连续5张均未找到隐球菌。
考虑不排除隐球菌脑膜炎，联系临床，得知患者腰穿测量颅压不高，与隐球菌脑炎所致高颅压不符，继续跟踪病原学结果。5月21号起停用氟康唑，改用两性霉素B抗隐球菌治疗。
图5 脑脊液抗原阳性
考虑脑脊液隐球菌抗原阳性，将脑脊液注射进儿童瓶上机培养，7天后仪器报阴性结果。
难道真的没有隐球菌生长？为了对患者生命健康高度负责，我们继续将儿童瓶放回仪器继续延长培养，终于在第8天的时候报阳了，革兰染色见圆形孢子，同时转接血平板和SDA平板，最终经质谱鉴定为新型隐球菌。
图6 脑脊液培养至第8天报阳曲线，隐球菌在血平板、SDA平板的菌落形态
图7 脑脊液转板SDA培养隐球菌质谱结果峰图
综上所述，结合肺泡灌洗液培养、NGS检测结果、病理结果，脑脊液隐球菌抗原、脑脊液培养结果，确诊为肺隐球菌病、肺孢子菌肺炎、隐球菌脑膜炎，根据病原学结果，患者及时进行治疗。
新生隐球菌为条件致病菌，广泛存在于环境，主要侵犯中枢神经系统引起隐球菌性脑膜炎。HIV感染是导致隐球菌感染的主要危险因素之一，但近年来关于非HIV患者隐球菌感染的报道不断增加。大量研究发现，中国、日本等东北亚地区国家的隐球菌感染多发生于HIV阴性的免疫功能正常人群。
新生隐球菌主要通过呼吸道传播感染，空气中的播散孢子或小荚膜菌体可经过呼吸道进入肺泡间质，而后穿越肺泡毛细血管屏障进入血液。有研究指出，新生隐球菌主要通过“特洛伊木马”机制、跨血管内皮细胞及细胞旁路途径3种方式穿越血脑屏障进入脑脊液引发感染。
隐球菌病原学的实验室检查主要直接镜检、隐球菌培养、Cr Ag检测、组织病理学检查、宏基因测序等。利用脑脊液、支气管灌洗液等标本进行墨汁染色后直接镜检是检测隐球菌的常用方法，方便快捷。培养是隐球菌病病原学诊断的金标准，具有较高敏感性，但耗时较长。
隐球菌抗原检测因敏感性及特异性均较高，被广泛应用于临床，但抗原浓度过高引起的“后带现象（postzone effect）”，会导致假阴性结果。有研究表明二代宏基因组测序（m NGS）诊断HIV阴性人群脑脊液中隐球菌感染的敏感性为93.5%，特异性为96%，该方法检测成本高，易受外源微生物污染的干扰。
隐球菌病的确诊主要依靠组织病理检查和病灶内脓液穿刺标本的病原学涂片和培养，脑脊液和血清隐球菌荚膜多糖抗原检测阳性也可确诊隐球菌病。
隐球菌感染推荐的相关治疗方案：
1、艾滋病合并隐球菌病诊疗专家共识（2024年更新版）
2、热病-桑福德抗微生物治疗指南（第50版）：
本案例患者“因腹泻7月余”入院，患者HIV抗体检测阴性，早期无咳嗽咳痰、无头痛、头晕等症状。随后治疗过程中，患者出现咳嗽、头痛、发热，肺部CT影像提示结节和双肺炎症，颅脑(MR)提示左侧小脑半球病灶。
行肺泡灌洗液NGS提示隐球菌和耶氏肺孢子菌，脑脊液常规白细胞轻度升高，以单核细胞为主；脑脊液蛋白升高，葡萄糖和氯化物水平降低，与相关研究报道相符；且该患者隐球菌抗原阳性，通过延长培养最后在肺泡灌洗液和脑脊液均检出新型隐球菌，因而可以明确这是1例耶氏肺孢子菌肺炎合并由隐球菌引起的隐球菌肺炎并发隐球菌脑膜炎。
参考文献
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编辑：李玲 审校：陈雪礼
