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产后抑郁症(PPD)是一种严重的精神疾病，影响大约10%-20% 的产后妇女。目前产后抑郁症发病的确切机制仍然无法确定，从而限制了临床治疗手段的进一步发展。据文献报道肠道微生物菌群失调会导致重度抑郁症。然而，肠道微生物群与产后抑郁症之间的关联仍未得到认证。因为卵巢激素停药后会引起小鼠抑郁样和焦虑样行为以及肠道微生物群组成的改变。本篇文章通过对小鼠进行卵巢切除术（OVX）后使用激素模拟假妊娠（HSP-H）模型，然后突然停用卵巢类固醇激素来建立小鼠PPD模型。将PPD小鼠的粪便微生物群移植（FMT）到抗生素治疗后的小鼠体内，可诱导受体小鼠出现抑郁样和焦虑样行为以及海马神经炎症病理学变化。而将健康小鼠的粪便微生物移植到 PPD 小鼠的体内会减轻PPD小鼠抑郁样和焦虑样行为，以及降低肠道和海马中NOD 样受体蛋白 (NLRP)-3/caspase-1 信号通路所介导的炎症，通过增加 PPD小鼠中产生短链脂肪酸（SCFA的细菌和减少阿克曼氏菌来提高粪便中短链脂肪酸 (SCFA)的水平来缓解肠道菌群失调。此外，海马中 NLRP3的下调可减轻PPD小鼠的抑郁样行为，而海马齿状回中 NLRP3 的过度表达可诱导幼稚雌性小鼠产生抑郁样行为。有意思的是，将健康小鼠的粪便微生物移植到PPD小鼠体内未能缓解海马体中NLRP3过度表达所导致地抑郁样行为。本实验的结果强调了NLRP3炎症小体是肠道微生物标记物-脑轴内的关键组成部分，这表明针对肠道微生物群可能是改善PPD的一种治疗策略。在Brain Behav Immun发表题为“Gut microbiota dysbiosis contributes to depression-like behaviors via hippocampal NLRP3-mediated neuroinflammation in a postpartum depression mouse model”的研究论文。
研究背景
产后抑郁症(PPD) 是一种严重的精神障碍，影响大约 10%–20% 的育龄妇女。然而，由于我们对产后抑郁症的机制知之甚少，目前临床上能够阻止或逆转产后抑郁症进展的有效治疗方法非常有限。许多研究报告称，产后抑郁症与激素、遗传和神经炎症高度相关。卵巢激素在怀孕期间急剧增加，并在分娩后突然降低至卵泡早期水平。这些激素的变化可能会导致易感女性患上抑郁症。此外，之前的研究表明激素波动会导致肠道微生物菌群发生变化。例如，卵巢切除术显著改变了小鼠体内冷杉微菌和拟杆菌的丰度，导致肠道菌群失调。最近的文献表明肠道菌群失调可能对抑郁症的进展产生影响。通过使用益生菌进行以微生物群为导向的治疗可以减轻抑郁症患者的抑郁症状。胃肠道含有多种微生物，包括有益细菌和有害细菌，从而形成复杂的网络结构。最近，研究人员认识到，与神经系统发育密切相关的共生微生物菌群参与神经发生、突触可塑性、神经元的维持、血脑屏障（BBB）、星形胶质细胞激活以及神经免疫和神经炎症反应。因为炎症细胞因子（包括肿瘤坏死因子 (TNF-α、白细胞介素 (IL-1β 和 IL-6）水平的升高，导致产后抑郁样行为的发生，于是临床前和临床研究假设促炎细胞因子在产后抑郁样行为的发生中发挥关键作用，并且在PPD患者中已有报道。肠道微生物菌群通过各种途径和大脑关联，包括免疫系统和神经系统，这可能涉及微生物代谢产物，例如短链脂肪酸 (SCFA)。SCFA 可能具有调节大脑中星形胶质细胞激活的能力，这表明肠道微生物群衍生的 SCFA在预防神经炎症过程方面具有重要作用。然而，目前尚不清楚海马炎症是否通过微生物群衍生的SCFA的作用而受到宿主微生物菌群的影响。 微生物靶向技术作为重建正常微生物菌群的一种方法，[如粪便微生物菌群移植 (FMT)] ,已被认为是治疗艰难梭菌感染和炎症性肠病的治疗工具。最近的研究表明，FMT 治疗对治疗多种非胃肠道疾病（例如自闭症谱系障碍和帕金森病）具有有益作用。此外，张等人表明，从NOD 样受体蛋白NLRP-3 KO小鼠粪便微生物菌群移植可使慢性不可预测应激(CUS)诱导的抑郁症小鼠的抑郁症得到缓解。然而，关于FMT治疗 PPD 的证据仍然有限。本研究旨在评估肠道微生物菌群靶向治疗对情绪障碍的保护作用，并探讨肠脑轴在调节小鼠卵巢激素撤退诱导的抑郁行为中的潜在作用。
研究结果
1.卵巢激素戒断导致情绪障碍和微生物菌群组成改变
与之前的报道一致，和假手术组小鼠相比HSPP组小鼠的体重在实验期第一周后明显增加（图1B）。卵巢激素停药后小鼠出现抑郁样行为，FST实验（图 1C）和 TST实验（图 1D）的静止时间比假手术组小鼠时间更长。在OFT实验中，HSPP组在中心区域所处的时间和进入次数比假手术组更短（图1E）（补充图S1A）。代表性运动轨迹如（图 1F）所示。在明/暗盒实验中，与假手术组小鼠相比，HSPP组小鼠在明箱花费的时间显著减少（图 1G）。小鼠明/暗室转换的次数也可以观察到相同的结果（补充图S1B）。总而言之，这些不同的行为学测试表明，停止卵巢激素分泌后会诱发抑郁样和焦虑样行为。本实验使用了16S rDNA 测序来比较HSPP组小鼠和假手术组小鼠的粪便微生物群特征。a-多样性指数 Shannon 和Simpson用来反映细菌种群内的丰富度和均匀度。可以从（图 1H、I）得出HSPP组小鼠粪便微生物样本的多样性和物种均匀度均较低。Beta 多样性分析（主成分分析，PCA）显示，根据粪便微生物群，两组小鼠之间存在明显的差异（图 1J）。在细菌门水平上，我们发现卵巢激素停用后肠道微生物群组成发生显著变化（图1K），HSPP组中厚壁菌门丰度减少，厚壁菌门与拟杆菌门比例下降（补充图S1C-D）。为了测试卵巢激素停药是否对肠道屏障通透性有影响，我们定量了血清中 FITC 标记的葡聚糖 (FITC-D) (4 KD) 的荧光水平，发现肠道通透性没有变化（补充图 S1E）。卵巢激素停药后，肠上皮没有表现出明显的超微结构变化（图1L，红色箭头）。如图S1F-H所示，卵巢激素停药后并没有改变参与紧密连接的几个基因的mRNA水平，例如claudin-1、occludin和封闭带(ZO-1)。这些数据表明，停止卵巢激素的供应会改变微生物群组成，但是不影响肠道通透性。![]()
图1.卵巢激素停药后的行为结果、肠道微生物群组成和肠道屏障
2.将HSPP小鼠的粪便菌群微生物群移植到 ABX 小鼠体内，可转移类似焦虑和抑郁的行为
为了确定肠道微生物群组成的变化是否与观察到的表型之间具有因果关系，我们使用抗生素混合物（ABX）来消除受体原始肠道微生物种群的干扰。对SPF小鼠进行抗生素治疗会使肠道微生物丰富度显著降低（补充图S2A、B）。经过抗生素混合物的长期治疗后，对ABX组小鼠进行粪菌移植（FMT），将假手术组小鼠和 HSPP组小鼠的粪便微生物移植到ABX组小鼠体内（图 2A、B）。FMT一周和两周后，接受 HSPP粪菌移植的小鼠在 FST（图 2C）和 TST（图 2D）中均表现出抑郁样行为。与HSPP供体小鼠相似，受体小鼠在 FMT 两周后也表现出焦虑相关行为（图 2E、F）。由于PPD的异质性，我们使用了另一种PPD动物模型，其中测试了CUS 对产后雌性小鼠抑郁样和焦虑样行为的影响（补充图 S2 C-F）。CUS微生物群的受体小鼠表现出抑郁样行为和焦虑相关行为（补充图 S2 GJ）。这些数据表明，通过移植HSPP小鼠或CUS小鼠体内粪便微生物菌群，产后抑郁样和焦虑样行为的特征可以转移到经过ABX治疗的受体小鼠体内。![]()
图2.HSPP 小鼠的 FMT 在 ABX 治疗的小鼠中诱导抑郁样和焦虑样行为
3.HSPP 小鼠的微生物菌群改变了ABX组小鼠海马的神经炎症和突触蛋白表达
为了研究肠道微生物菌群是否影响卵巢激素停药后海马体神经元的活性，本实验通过测量早期基因c-Fos的表达来作为海马体神经元活性的表现。卵巢激素停药后，在 FST实验后后90分钟处死小鼠（即c-Fos 表达达到峰值的时间），以测量海马中早期基因 c-Fos 的表达。卵巢激素停药后，在海马 DG（图 3A，B）和 CA3（补充图 S3 A，B）中c-Fos阳性细胞的表达增加，但是海马CA1 中没有增加（补充图 S3C，D）。接受了来自HSPP组粪菌移植的的受体组小鼠区DG 的 c-Fos 阳性细胞水平增加，但 CA3中的c-Fos阳性细胞水平没有增加（图 3 A、B）。本实验的结论是转移卵巢激素停药后强迫游泳的小鼠的粪便微生物菌群会激活海马 DG区的活性。通过GFAP作为标记物对DG区域进行免疫荧光染色标记以检测星形胶质细胞的活化。HSPP组小鼠DG区GFAP阳性星形胶质细胞的数量显著高于假手术组（图3C、D）。与FMT-sham组相比，接受HSPP微生物菌群小鼠的海马DG区域的星形胶质细胞数量也会更高（图 3C、D）。此外，通过蛋白质印迹分析测量了几种突触蛋白的水平，包括突触后蛋白（PSD95）和突触前蛋白（synapsin-1），结果显示它们在HSPP小鼠中的表达低于假手术小鼠 (图3E-G)。与 FMT-Sham 小鼠相比，接受HSPP粪菌微生物移植的受体组也表现出海马区突触缺失（图 3H-J）。![]()
图3.HSPP 小鼠的 FMT 增加了 ABX 治疗小鼠海马的神经炎症并降低了突触蛋白表达
4.FMT治疗减轻了HSPP小鼠的抑郁样和焦虑样行为
为了验证肠道微生物菌群对PPD的治疗作用，本实验对PPD小鼠进行了 FMT 治疗，即将健康小鼠的粪便菌群移植到HSPP小鼠体内。（图 4A）。第 23-30 天，sham组小鼠和 HSPP组小鼠均接受 FMT 治疗或予以普通生理盐水（图 4 A-B）。Sham-NS组和 Sham-FMT 组之间没有情绪行为学差异。与HSPP-NS组相比，HSPP-FMT组的FST和TST静止时间降低（图4C-D）。与 HSPP-NS 组相比，HSPP-FMT 组的小鼠表现出显着更高的总行驶距离以及更高的中心区域时间（图 4 E-F）、明室时间和进入次数（图 4 G）。FMT 治疗后 HSPP 小鼠的体重没有显著变化（补充图 S4A）。总体而言，这些结果表明，将健康小鼠的粪菌微生物菌群FMT到HSPP小鼠体内可以缓解由于卵巢激素停药后而导致的异常情绪行为。![]()
图4.FMT 治疗对焦虑样和抑郁样行为的影响
5.FMT对HSPP小鼠大脑和结肠的影响
（1）FMT治疗降低HSPP小鼠海马神经炎症并增加突触蛋白表达将HSPP小鼠体内的粪便菌群微生物菌群移植到经过ABX治疗后的受体小鼠体内可能会影响海马体的活动，这一观察结果促使我们研究这种变化背后的分子机制。HSPP-NS组的GFAP阳性细胞数量高于Sham-NS组，而FMT治疗减弱了GFAP激活（图5A，B)。此外，促炎分子的蛋白质水平，如 NLRP3 和 caspase-1，HSPP-NS 小鼠比 Sham-NS 小鼠的海马内含量高。而 HSPP-FMT 小鼠中这些分子的水平明显较低（图 5C-E）。突触变化是抑郁症的重要组成部分，主要由不对称突触（推测为兴奋性，图5F红色箭头）介导，其由比突触前部分更厚的突触后密度（PSD）定义。通过使用电子显微镜检查海马DG区的突触超微结构。HSPP-NS 小鼠的 PSD 比 Sham-NS 小鼠的PSD更薄，FMT治疗恢复了突触后密度厚度和裂隙长度（图 5G）。此外，FMT治疗显着逆转了HSPP小鼠海马突触蛋白（PSD95、突触蛋白-1）水平的降低（图5H、I）。![]()
图5.FMT治疗对HSPP小鼠海马神经病理变化的影响
（2）FMT 治疗抑制 HSPP小鼠结肠中促炎蛋白的产生本实验研究了FMT治疗对结肠炎症的影响。免疫组化染色结果显示，HSPP-NS组NLRP3和caspase-1细胞阳性染色增多,而 HSPP-FMT 处理显著降低了这些分子的表达（图 6A-C）。此外，HSPP-NS小鼠结肠中促炎分子（例如NLRP3和caspase-1）的蛋白质水平高于Sham-NS小鼠，而FMT治疗显着降低了这些分子的水平（图6D-F）。![]()
图6.FMT治疗对结肠中 NLRP3 炎性小体激活的影响
（3）FMT 治疗缓解HSPP小鼠肠道微生物群失调为了验证FMT治疗是否调节肠道微生物菌群，为此进行了16S rDNA 基因测序以分析HSPP小鼠微生物菌群移植治疗后的细菌分类组成。如图7A和B所示，HSPP-NS组的Shannon指数和Simpson指数低于Sham-NS组，而HSPP-FMT组的指数高于HSPP-NS组。HSPP-FMT 和 HSPP-NS 组之间的Chao1指数没有显著差异（图 7C）。基于杰卡德距离矩阵的主成分分析（PCoA）用于测量β多样性。Adonis 分析显示，FMT 治疗改变了肠道微生物群落结构（R2 = 0.28；p < 0.01）（图 7D）。在门水平上，HSPP-NS组中的厚壁菌门丰度显着低于Sham-NS组，而FMT处理显着增加了丰度（图7E-F）。相反，另一个门疣微菌门在HSPP-NS组和Sham-FMT组中的丰度高于Sham-NS组，但在HSPP-FMT组中丰度降低（图7E-F）。图7G总结了属水平上显著不同的物种。与Sham-NS组相比，有害菌属Akkermansia和Bacteroides的相对丰度显着升高，而有益菌属Lachnospiraceae-NK4A136 组、Lachnospir aceae-unclassified、Alistipes 和 Ruminococcaceae-UCG-014 在 HSPP-NS 组中丰度显着降低（图 7H）。FMT 治疗显着降低了阿克曼氏菌的丰度，同时增加了有益细菌乳杆菌的相对丰度，在HSPP-FMT组中观察到Lachnospiraceae-NK4A136组、Muribaculum、Duncaniella和Rumi nococcaceae-UCG-014（图7H）。所有这些数据表明，FMT 治疗可减轻卵巢激素中断引起的肠道微生物菌群紊乱。![]()
图7.FMT 治疗对肠道微生物群的影响
（4）FMT 治疗提高了 HSPP 小鼠粪便 SCFA 水平进行LEfSe 分析（图 8A，p < 0.05，LDA 值 > 3 ，有显著影响）和分支图分析（图 8B，基于每个水平的最大相对丰度差异） 检测各组中与 SCFA相关的微生物菌群生物标志物。我们发现产生SCFA的细菌有如g_Lachnospir aceae_NK4A136_group、g_Alistipes、g_Ruminiclostridium、f_Clostridiaceae、g_Clostridium、g_Ruminococcaceae_UCG_009、g_Eubacteria和f_Eubac teriaceae在Sham-NS组中具有很高的显著性（LDA值> 3）。同时，g_Ruminococca ceae_UCG_013、g_Lachnoclostridium、g_Butyricicoccus、s_Roseburia_sp_和g_Ruminococcaceae_unclassified是产生SCFA的细菌，在Sham-FMT 组具有高影响力（LDA 评分> 3）。然而，HSPP-NS 组中产生SCFA 的细菌（g_Akkermansia 和 g_Bacteroides）较少。LEfSe 分析证实了 HSPP-NS 和 HSPP-FMT 组之间产生 SCFA 的细菌种类存在差异，在 HSPP-FMT 组中观察到更富集的产生SCFA的细菌，如（g-Dubosiella、g-Ruminococcaceae_UCG_014、g-Lachnospir aceae-UCG_006、g-Bifidobacteria、o-Bifidobacteriales 和 f_Bifidobacteriaceae）。此外，分支图分析进一步表明Sham-FMT组中g_Eubacter iumxylanophilum group的丰度和HSPP-FMT组中g-Ruminococca ceae-UCG-010的丰度。我们进一步检测了不同组粪便中SCFA 的含量，包括乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、戊酸、异戊酸和己酸。所有组之间的总 SCFA 没有发现具有显著差异（图 8C）。然而，HSPP-NS 组的SCFA总量较低。丁酸盐浓度高于Sham-NS 组，通过 FMT 治疗可显著恢复（图 8D）。HSPP-NS 小鼠中的异丁酸（图 8E）和异戊酸水平（图 8F）也低于 Sham-NS 组，这与丁酸水平类似，而且FMT 治疗显著增加了 HSPP-NS 中粪便异丁酸和异戊酸水平。其他 SCFA（如乙酸、丙酸、戊酸和己酸）的水平在粪便中没有显示出显着差异（补充图 S4B-E）。如图8G-I所示，丁酸、异丁酸和异戊酸的含量与DG中GFAP阳性细胞的水平呈负相关。数据表明，粪便 SCFA 在 FMT 介导的海马神经炎症减轻中发挥着重要作用。![]()
图8.FMT 治疗增加了 HSPP 小鼠中产生 SCFA 的细菌种类并改变了粪便 SCFA 的水平
6.HSPP 小鼠肠道微生物群通过海马 NLRP3 介导的神经炎症调节抑郁样行为
免疫荧光染色显示与Sham组小鼠相比，HSPP组小鼠海马DG区域中 NLRP3 表达显著上调（图 9A、B）。为了确定 NLRP3 在抑郁样行为中的作用，通过在HSPP组小鼠中使用 NLRP3-shRNA 显微注射下调海马 DG 中 NLRP3 的表达。通过EGFP荧光确认注射位点，并且在接受NLRP3 shRNA的小鼠中检测到NLRP3蛋白水平降低（图9C、D）。海马 NLRP3 敲低导致 HSPP小鼠的FST和TST实验中保持静止的时间减少，但在旷场和明暗盒测试期间未观察到焦虑样行为的显著变化（图 9E，F）。通过 AAV 转染，海马NLRP3表达增加。注射部位已确认检测到 EGFP 荧光，并且 NLRP3 蛋白水平显着增加（图 9G，H）。海马 DG 中NLRP3 的过表达显著增加了幼稚鼠在 FST和TST实验期间保持静止地时间，但不影响在中心区的时间和在光室中的时间（图 9I，J）。为了确定NLRP3在介导肠道微生物失调对PPD抑郁样行为的影响中的作用，我们利用AAV转染上调HSPP-FMT小鼠海马DG中的NLRP3表达（图9K）。当 NLRP3 在海马DG区域中过度表达时，FMT 治疗的抗抑郁效果会受到损害（图 9L-M）。这些结果表明，FMT 疗法通过抑制海马 DG 中的 NLRP3 来减轻 HSPP诱导的抑郁样行为。![]()
图9.NLRP3在海马区的过度表达和敲除对焦虑和抑郁样行为的影响.AGO2的丙二酰化损害了其线粒体易位
7.相关性支持PPD小鼠模型中微生物群-肠-脑轴的参与
通过Spearman相关系数评估肠道微生物和临床参数之间的干扰，以反映肠道微生物水平和情绪行为的相关性。明/暗光转换、亮光时间、中心进入和中心时间与焦虑样行为呈负相关，而TST不动时间和FST不动时间与抑郁样行为呈正相关。如图10A所示，Alistipes丰度与光照时间、中心进入次数和中心时间呈正相关，表明Alistipes与焦虑样行为呈负相关。Akkermansia 和 Bacteroides 丰度与抑郁样行为和海马神经炎症（DG 中的 GFAP 阳性细胞）呈正相关。研究发现 Lach nospiracea-NK4A136 组的丰度与焦虑样行为、体重和 FST 不动时间呈负相关。此外，一些属的丰度，如双歧杆菌和乳酸杆菌，与抑郁样症状呈显著负相关行为。我们进一步评估了海马神经炎症和粪便产生SCFA 水平是否与许多临床参数相关（图 10B）。发现DG区GFAP+细胞的数量与焦虑样、抑郁样行为和体重呈显着正相关。此外，异戊酸、丁酸和异丁酸的含量与焦虑样行为和抑郁样行为呈负相关。此外，丁酸含量与体重呈负相关。数据表明，粪便 SCFA 和海马神经炎症在 FMT 介导的抑郁样和焦虑样行为减弱中发挥重要作用。![]()
图10.不同结果之间的相关性支持了微生物-肠-脑轴可能参与了卵巢激素撤药诱导的抑郁小鼠模型
研究小结
本实验研究为卵巢激素停止分泌后肠道菌群失调与情绪障碍之间的联系提供了一些重要的新见解。本研究表明，FMT 治疗可缓解肠道微生物群失调，通过抑制肠道和大脑中NLRP3/caspase-1 信号通路介导的炎症，从而提高微生物 SCFA 水平，防止卵巢激素停止分泌后引起的情绪障碍。NLRP3 炎症小体作为微生物群-肠道-炎症-脑轴中的出现的关键介质。这些发现强调了肠道微生物菌群和 NLRP3 炎性因子可以被认为是治疗和预防产后抑郁症的新靶点。
原文链接
Xu Q, Sun L, Chen Q, et al. Gut microbiota dysbiosis contributes to depression-like behaviors via hippocampal NLRP3-mediated neuroinflammation in a postpartum depression mouse model. Brain Behav Immun. 2024;119:220-235. doi:10.1016/j.bbi.2024.04.002.
本文内容来源于上海市第一人民医院麻醉科，版权归原作者所有
文案：张缠花 ；指导老师：黄丽娜；编辑：周宇；审核：陈峰 / 李金宝
编辑：柴若兰
审校：陈小星
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