今天，小派介绍一下两位表观组学的常客 Chip-seq与ATAC-seq，尽管这两种技术在测序流程和数据处理方面具有诸多共性，比如都涉及基因组mapping，peak calling，peak注释，差异peak分析，motif分析等步骤，并且它们常与其他组学技术如 RNA-seq 结合，以揭示蛋白质调控基因机制。但两者在研究目标和实际应用方面有明显差异。小派这就来跟大家分享一下他们的技术原理，以及在那些高分文章中他们是怎么大展拳脚的。文尾小派还整理了表观遗传研究高分文章常见实验技术和联用示例哦~。
一．首先我们初步了解一下ATAC-seq和Chip-seq
ATAC-seq（Assay for Transposase-Accessible Chromatin using sequencing）是一种高通量测序技术，旨在研究基因组中开放染色质区域。该方法能够快速、灵敏地识别出基因组上哪些区域的染色质结构较为松散，从而使得DNA更容易被蛋白质因子如转录因子结合。
ChIP-seq（Chromatin Immunoprecipitation Sequencing）是一种高通量测序技术，专门用于研究蛋白质与DNA之间的相互作用，能够精确地识别特定蛋白质，例如转录因子和组蛋白，在基因组中的结合位点。
如果想进一步了解ATAC-seq和Chip-seq的实验原理以及分析结果上的差别，赶紧看看咱们往期详细讲解的软文哦！
CHIP-Seq的10问10答（点击查看）
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二．ATAC-seq和ChIP-seq到底有啥区别？
Chip-seq是实验前明确有一个感兴趣的转录因子，根据目标转录因子设计抗体去做Chip-seq实验拉DNA，验证感兴趣的转录因子是否与DNA存在相互作用；而ATAC-Seq一般用于不知道特定的转录因子，是在全基因组范围内检测染色质的开放程度，可以得到全基因组范围内的蛋白质可能结合的位点信息，用这个技术方法与其他方法结合是想去筛感兴趣的调控因子。
三．那有没有必要两个组学测序都做呢？两者是否需要联用？
Chip-seq和ATAC-seq分别用于研究蛋白质-DNA相互作用和开放染色质区域，然而，为了获得更全面和深入的生物学见解，通常需要将这些技术与其他测序技术和验证实验相结合，以串联起整个实验流程。这种多技术联用的方法能够提供多层次的数据，从而更好地理解基因调控网络、表观遗传学机制以及细胞功能。
四．常见的组合分析方式
1、ATAC-seq+RNA-seq:
在常规思路中，RNA-seq通常优先于ATAC-seq进行实验，获得差异表达基因后，后续可进一步运用ATAC-seq的motif分析，对启动子区域的染色体开放性染色质开放性发生变化的差异基因进行深入探究，并识别出特定的转录因子结合情况，基于这些分析结果，再进行后续的验证实验。
另一个思路是，通过ATAC-seq技术检测染色质开放区域的DNA，初步看一下分布在基因启动子区域的差异peak，随后进行RNA-seq实验，对差异peak注释基因与RNA差异表达基因的交集进行功能分析，以揭示其潜在的生物学功能，最终，结合实验进行验证，以确保研究结果的准确性。
2、ATAC-seq+Chip-seq+RNA-seq:
ATAC-seq之后需要做Chip-seq来做进一步的验证。比如ATAC-seq得到染色质开放区域的差异peak后，通过motif分析筛到了转录因子，随后利用Chip-seq可以精确地定位这些转录因子作用位点。这一步用于揭示哪些转录因子通过与开放染色质区域的可及性的变化，进而对下游目标基因产生影响。最后可以通过RNA-seq确认可以验证这些转录因子靶向的基因中哪些基因表达发生了显著变化，进一步探究这些基因如何通过特定的信号通路影响最终的表型变化。通过“染色质可及性变化－转录因子－靶基因－通路－表型”串联起整个调控网络。
五．项目文章
下面，小派将为大家分享两篇关于ATAC-seq和Chip-seq与其他技术联用分析的项目文章。这些文章展示了如何巧妙地将这两种强大的技术与其他方法结合，共同攻坚克难，拨开重重迷雾，揭示出隐藏在复杂生物现象背后的真相。
项目文章一
CUT&Tag、ATAC-seq助力揭秘神经肽信号调控T细胞分化
(IF= 50.5)
文章题目：Neuropeptide signaling orchestrates T cell differentiation
文章期刊：Nature
技术手段：CUT&Tag、ATAC-seq、scRNA-seq、RNA-seq
技术路径：
主要研究结果
CGRP-RAMP3-cAMP 轴激活 STAT1
为了深入理解CGRP如何诱导TH1细胞程序，作者对经CGRP处理的CD4+ T细胞进行了转录组和ATAC-seq分析。研究发现，在TH1或TH2细胞分化条件下，CGRP诱导的染色质可及性和表达谱发生了变化（图5a）。具体来说，对CGRP的反应中TH1细胞早期调节基因如Il12rb2、Il18r1和Stat1的表达上调（图5b），这些基因位点的染色质可及性也更高（图5c、d）。这表明CGRP通过改变染色质的可及性，促进了TH1细胞的早期调节基因表达，从而促进TH1细胞的分化。
CGRP增加了与IFNγ信号通路相关的基因的染色质可及性，如Irf4、Irf8、Gbp7、Rap1a和Socs1，在TH1和TH2细胞条件下均是如此（图5e）。同时，TH2细胞调节因子Gata3和Il13在CGRP处理后失去了染色质可及性（图5f）。因此，CGRP通过表观遗传重构调节TH细胞亚型分化。
在T细胞中，p-CREB和ATF3都被CGRP诱导（图5g），CREB在Atf3基因启动子的结合位点通过CUT&TAG和ChIP-qPCR检测在T细胞中得到确认（图5i）。CGRP增强的TH1细胞分化和CGRP诱导的Stat1在Atf3缺陷的T细胞中都被取消了（图5j），这表明CGRP通过ATF3诱导Stat1。作者进行了ChIP-qPCR并发现ATF3结合到Stat1的启动子区域（图5k）并诱导Stat1基因表达。最后，CGRP诱导的TH1细胞早期调节因子（Stat4和Il12rb2）在Stat1缺陷细胞中被取消了（图5l）。总的来说，RAMP3-CREB-ATF3通过诱导关键转录因子STAT1来调节TH1细胞分化。
图5：CGRP-RAMP3-cAMP通过表观基因组重塑和STAT1激活增强TH1细胞分化
项目文章一分析结果详细结果可见往期软文：派森诺客户表观组学研究成果荣登《Nature》！！！CUT&Tag、ATAC-seq助力揭秘神经肽信号调控T细胞分化
项目文章二
BRD9介导的染色质重塑通过负反馈机制抑制破骨形成
(IF= 17.7)
文章题目：chromatin remodeling suppresses osteoclastogenesis through negative feedback mechanism
文章期刊：Nature Communications
技术手段：Chip-seq、ATAC-seq、RNA-seq
技术路径：
主要研究成果
BRD9通过干扰素-β 信号传导抑制破骨细胞生成
在破骨细胞与M-CSF和RANKL (MR+iBRD9) 和对照组 (MR+vector) 分化过程中，对BMDMs进行了mRNA测序。在生物过程中，GO term主要富集在防御反应、对干扰素-β (IFN-β)和外部刺激的反应、免疫系统过程(图4b)。GSEA揭示了IFN-β 反应、乙酰胆碱受体信号和免疫受体活性在MR+iBRD9组被显著下调，而核糖体生物发生、突触传递和rRNA加工被上调 (图4c，d)。RANKL在破骨细胞形成过程中激活IFN-β，STAT1，STAT2，从而促进IFN-β 信号传导 (图4e)。而在iBRD9处理后，RANKL诱导的BMDMs中IFN-β 信号活性被下调 (图4f)。我们认为BMDMs中brd9介导的IFN-β信号通路的可能负反馈调节破骨细胞的形成。
图4：BRD9介导的干扰素-β信号的转录激活负调控破骨细胞的形成
Stat1抑制BRD9介导破骨细胞生成至关重要
为了进一步阐明BRD9如何在RANKL诱导的破骨细胞生成的负反馈过程中参与转录调控，进行了ChIP 测序。KEGG富集分析揭示了BRD9的关键转录调控在信号转导、信号分子和相互作用以及免疫应答方面的富集 。蛋白质-蛋白质相互作用 (PPI) 分析确定了基因列表中的几个关键枢纽基因可能是BRD9的直接下游靶标。通过一系列分子实验，结果表明，BRD9通过直接调控Stat1的启动子和增强子活性来促进Stat1的转录 (图5)。
图5：在破骨细胞形成过程中，STAT1对于BRD9介导的负反馈调节至关重要
FOXP1与BRD9在Stat1转录调控上相互作用
为了研究BRD9的染色质重塑功能以及可能促进BRD9在破骨细胞形成中的负面作用的辅助因子，进行了ATAC-seq和motif分析。结果表明MXI1、SRY、Arid3a、ZNF354C、FOXP1与BRD9有潜在的协同作用。共免疫沉淀 (IP) 证实了BRD9和FOXP1之间的相互作用 (图6)。利用慢病毒载体进行了ChIP-qPCR和FOXP1敲低实验，进一步验证FOXP1对Stat1的结合和转录调控功能（图6k，I）。这些结果清楚地表明，在Stat1转录激活期间，FOXP1是BRD9的关键辅因子之一，并且在破骨细胞分化期间负反馈调节。
图6: FOXP1与BRD9相互作用，在破骨细胞形成过程中调节Stat1的转录
文章二分析结果详细结果可见往期软文：【派森诺多组学项目文章】转录组+ChIP-seq+ATAC-seq共同揭示BRD9在破骨细胞形成过程中的负反馈机制
六．表观遗传研究高分文章常见实验技术
（1）ChIP-qPCR （染色质免疫共沉淀定量PCR）：
原理：通过特异性抗体捕获与DNA结合的蛋白质，然后通过qPCR定量特定区域的富集程度。
应用：验证ChIP-seq数据中的特定结合位点，或者在没有进行全基因组测序的情况下，检测特定区域的蛋白质-DNA相互作用。
（2）Co-IP （共免疫沉淀）：
原理：使用一种特异性抗体捕获目标蛋白及其相互作用的伴侣蛋白，从而鉴定蛋白质复合物。
应用：研究蛋白质-蛋白质相互作用，特别是在表观遗传调控复合物的研究中非常有用。
（3）EMSA （电泳迁移率变动分析）：
原理：通过凝胶电泳检测蛋白质与DNA片段的结合情况。
应用：验证转录因子或其他蛋白质与特定DNA序列的直接结合。
（4）DNase I 超敏感位点分析 (DNase I hypersensitivity site analysis, DHS)：
原理：利用DNase I酶消化开放染色质区域，然后通过Southern blot或PCR检测。
应用：识别和定位开放染色质区域，这些区域通常是活性调节元件（如启动子、增强子）。
（5）Bisulfite PCR：
原理：使用亚硫酸氢盐处理DNA，将未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变，然后通过PCR扩增并测序。
应用：检测特定CpG位点的DNA甲基化状态。
（6）Western Blot：
原理：通过电泳分离蛋白质，然后用特异性抗体检测特定蛋白质的存在和表达水平。
应用：验证组蛋白修饰、转录因子或其他相关蛋白质的表达水平。
（7）Reporter Assay （报告基因检测）：
原理：将感兴趣的启动子或增强子序列克隆到报告基因载体中，然后转染细胞并检测报告基因的表达。
应用：评估特定调控序列的功能和活性。
（8）过表达
原理：通过将目标基因的cDNA克隆到表达载体中，然后将该载体转染到细胞中，使目标基因在细胞中高水平表达。可以使用不同的启动子来控制表达水平，常用的有CMV（巨细胞病毒）启动子和EF1α（延伸因子1α）启动子。
应用：功能验证：研究特定基因或蛋白质的功能，特别是在表观遗传调控中的作用。
机制研究：探索特定基因或蛋白质如何影响其他基因的表达、细胞周期、细胞分化等。
信号通路分析：确定特定基因或蛋白质在信号传导通路中的位置和作用。
常用技术：质粒转染；病毒载体；CRISPR/Cas9
（9）敲除实验
原理：通过基因编辑技术（如CRISPR/Cas9）删除或失活目标基因，使其无法表达。
可以实现完全敲除（KO）或条件性敲除（Conditional KO），后者可以在特定时间和/或特定细胞类型中进行敲除。
应用：功能验证：研究特定基因或蛋白质在细胞功能和表观遗传调控中的必要性。
机制研究：探索特定基因或蛋白质缺失后对细胞行为、信号通路和其他基因表达的影响。
疾病模型：构建基因敲除动物模型，研究特定基因在疾病发生发展中的作用。
常用技术：CRISPR/Cas9；Cre-LoxP系统。
七．联用示例
ChIP-qPCR + 过表达/敲除实验：
目的：验证特定转录因子或组蛋白修饰酶在特定基因调控区域的作用。
方法：先进行过表达或敲除实验，改变目标基因的表达水平。
然后进行ChIP-qPCR，检测特定调控区域的蛋白质-DNA相互作用是否发生变化。
例如，通过表达某个转录因子后，通过ChIP-qPCR检测其在靶基因启动子区域的富集程度是否增加。
Co-IP + 过表达/敲除实验：
目的：验证特定蛋白质与其他蛋白质的相互作用。
方法：先进行过表达或敲除实验，改变目标蛋白质的表达水平。然后进行Co-IP实验，检测目标蛋白质与其伴侣蛋白质的相互作用是否受到影响。
例如，敲除某个组蛋白修饰酶后，通过Co-IP检测其与特定转录因子的相互作用是否减弱。
通过这些联用实验，研究人员可以更全面地理解特定基因或蛋白质在表观遗传调控中的作用及其对细胞功能的影响。
八．最后小Tip
不同测序技术和结果整合起来仍然面临一些挑战。多组学测序的高成本、结果的统一标准化难题以及不同实验批次效应的干扰，都影响了数据的结果。
因此，在开展实验研究之前，若研究者对特定基因或转录因子感兴趣，建议通过检索相关数据库来探索潜在的靶向关系。目前存在专门的转录因子研究网站，可输入相应的motif序列或基因序列，网站会找到相对应的转录因子（可能是其他人文章验证过的或者预测的），常见的数据库有以下几个：
（1）AnimalTFDB:
提供了多种搜索浏览方式（Famliy、Species或自定义搜索）、2个在线预测工具Predict TF和Predict TFBS。
网址：https://guolab.wchscu.cn/AnimalTFDB4//#/
（2）PlantTFDB:
包含了从165个物种中预测的320370个TFs，并将其分成58个Family。
网址：https://planttfdb.gao-lab.org/index.php
（3）dbCoRC:
dbCoRC是第一个全面的交互式CRC数据库，也是核心启动因子数据库。
网址：http://cistrome.org/db/#
（4） TRRUST:
TRRUST是一个人工注释的转录调控网络数据库，不仅包含转录因子对应的靶基因，也包含了转录因子间的调控关系，并且提供的TF-target互作信息。
网址：https://www.grnpedia.org/trrust/
（5）TransmiR
TransmiR是收集转录因子（TF）-microRNA（miRNA）的数据库，通过它我们可以找到TF和miRNA之间的调控关系。
网址：http://www.cuilab.cn/transmir
项目文章一原文索引：
https://doi.org/10.1038/s41586-024-08049-w
项目文章二原文索引
https://www.nature.com/articles/s41467-023-37116-5
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