派森诺项目文章 | 生理指标检测+转录组测序，揭示水杨酸可显著提升向日葵耐盐性

不同浓度的SA对盐胁迫下向日葵植物光合作用参数的影响

在盐胁迫条件下，植株高度和茎直径明显下降；但与 NaCl 条件下相比，叶面喷施SA（尤其是SA2和SA3）能有效提高这些生长指标。对幼苗光合参数的比较表明，在盐胁迫下，Fv/Fo比值降低了18.0%，Fv/Fm比值降低了4.0%，PIabs降低了52.5%。外源施用SA1、SA2、SA3和SA4后，与单独施用NaCl相比，Fv/Fo、Fv/Fm、PIabs值都有增加。此外，当植物受到盐胁迫时，PSII反应中心（即ABS/RC、TRo/RC、DIo/RC和ETo/RC）的能量流参数也发生了一定程度的变化。总之，盐胁迫会在一定程度上抑制向日葵幼苗的光合作用，但外源SA可以缓解这种抑制作用。

图1 6个处理下向日葵幼苗表型及光合参数比较

盐胁迫下SA对向日葵ROS和抗氧化系统的影响

当遭受盐胁迫条件时，向日葵植物的MDA、O2.-、-OH和H2O2含量分别显著增加190.8％、52.4％、301.8％和357％。相反，与NaCl存在下观察到的结果相比，不同浓度的外源SA的存在导致ROS和MDA水平降低。表明SA的应用抑制了产生超氧自由基和羟基自由基，减轻对植物细胞的伤害，减轻氧化损伤。此外，SA2对MDA和O2.-的产生具有最大的抑制作用，SA4对-OH和H2O2的产生具有最大的抑制作用。NaCl处理增加了向日葵中抗氧化酶（SOD、POD和APX）的活性，但抑制了CAT活性。与其他处理相比，SA2诱导APX和SOD活性的增加。非酶抗氧化剂中，ASA-GSH系统中的AsA、GSH和DHA可以去除H2O2，维持AsA和GSH之间的平衡。盐胁迫下AsA、DHA和总AsA含量以及AsA/DHA比值增加。AsA和总AsA含量显著增加，分别增加了58.8%和20.6%，而DHA含量和AsA/DHA比值没有显著影响。外源SA处理后，随着SA浓度的增加，AsA和总AsA含量先升高后降低，其中AsA含量在SA2时达到峰值。综上，盐胁迫可以导致抗坏血酸的产生来保护细胞，而低浓度的SA可以进一步诱导幼苗产生更多的抗坏血酸，从而增强向日葵植株清除过量ROS的能力。

SA2和SA3的表达谱比其他处理更接近CK的表达谱

为了进一步研究SA减轻向日葵盐胁迫的潜在分子机制，我们对18个文库进行了RNA-seq（CK、NaCl、SA1、SA2、SA3、SA4），总共82782万个原始读数，经过质控得到了76037万条高质量读数。其中，大多数表达的基因（FPKM>1）表现出中等表达水平（1100）。对18个文库进行了层次聚类相关分析和PCA，以揭示生物重复和样本间表达谱的相似性。CK、NaCl和SA（SA1-4）样品明显分离，表明在盐胁迫下以及使用SA缓解盐胁迫时，表达谱发生了变化。SA1、SA2和SA3样品与CK接近，SA4和NaCl样品与CK相差较远，说明SA1、SA2和SA3对盐胁迫有一定缓解作用，且SA2和SA3的程度大致相同的效果。综上所述，SA尤其是SA2和SA3处理可以有效缓解盐胁迫。

不同浓度SA对盐胁迫下向日葵基因表达的影响

本研究重点关注五个比较组，并确定了总共11,312个DEG（P.adj<0.05，|log2FC|>1.0）。在这五个比较中确定了302个共享DEG，并且在除NaCl与CK外的四个比较中共享了382个DEG。根据302个共享DEG表达谱的层次聚类，DEG分为两个分支，一个由SA4和NaCl组成，另一个由CK、SA1、SA2和SA3组成。聚类模式表明SA1、SA2和SA3在一定程度上表现出缓解盐胁迫的良好潜力，接近CK组的缓解水平。相反，观察到SA4在缓解盐胁迫方面无效。本研究还检查了转录因子（TF）的表达模式，这些转录因子受到差异性调节，并在减轻外源SA对遭受盐胁迫的向日葵幼苗的影响方面发挥作用。差异表达转录因子数量最多的家族是ERF（乙烯反应因子）、bHLH（碱性螺旋-环-螺旋）、NAC、MYB、WRKY、C2H2、HD-ZIP（同源域-亮氨酸拉链）、MYB-相关的bZIP（碱性亮氨酸拉链）和COL（CO样）家族。总共鉴定出45个TF家族和727个TF成员，其中23个TF成员和32个TF家族在比较组之间共享。由此可见，许多TF家族参与了外源SA对盐胁迫的响应。最后，本研究随机选择10个基因，通过RT-qPCR进行表达定量，以验证RNA-seq结果的准确性。

DEG分析

与NaCl相比，在四种SA处理中，DEG在192、384、450和210个GO条目中显著富集，其中33个在比较中共享。有15个共享显著富集的BP，如细胞激素代谢过程、气孔运动和氧化还原辅酶代谢过程。在各个比较组中显著富集的其他BP包括对钙离子的反应、气孔复合体发育、气孔运动、SA代谢过程的调节、ROS生物合成过程、SA生物合成过程对SA的反应以及萜类生物合成过程。根据KEGG富集分析，15、10、16、12和13个KEGG通路分别在NaCl vs CK、SA1 vs NaCl、SA2 vs NaCl、SA3 vs NaCl和SA4 vs NaCl中显著富集，仅共享一个KEGG通路，即光合作用天线蛋白。SA1 vs NaCl和SA2 vs NaCl均表现出9个显著富集途径的共性，包括光合生物中的光合作用、碳代谢和碳固定。SA2 vs NaCl以及SA3 vs NaCl在10种常见通路中表现出显著富集，包括辅因子生物合成、卟啉代谢和核糖体。此外，SA3 vs NaCl和SA4 vs NaCl的比较揭示了四种常见途径的显着富集，包括次生代谢物的生物合成和MAPK信号途径植物。总之，植物盐胁迫的缓解可能涉及光合作用、植物激素信号转导、MAPK信号通路以及响应SA的次级代谢产物生物合成等过程。

DEG的K-means分析

为确定与向日葵响应盐胁迫和SA胁迫缓解作用相关的DEG的主要表达趋势，采用K-means聚类将11,312个DEG分为15个表达簇（C1-C15）。来自C2（1059，25个TF）、C3（975，90个TF）、C6（676，60个TF）、C9（534，58个TF）和C13（674，50个TF）的基因表达趋向于氯化钠处理后减少，并随着外源SA的应用而增加。来自C6、C9和C13的基因表达在SA2中达到峰值，来自其余两个簇（C2和C3）的基因表达在SA3中达到峰值，所有基因的表达在SA4中最低。此外，C5（1087，56个TF）和C10（1417，66个TF）的DEG在NaCl处理后表现出表达上调。随着外源SA浓度的增加，DEG的数量逐渐减少，在SA2或SA3达到峰值，之后DEG的数量增加。此外，C12中基因的表达在NaCl胁迫下保持不变。然而，随着SA浓度的增加，表达水平增加，在SA3中达到峰值，但在SA4中急剧下降。为了探索这些差异表达基因在减轻盐胁迫有害影响方面的可能作用，我们对这八个基因簇进行了GO和KEGG富集分析。盐胁迫下表达下调的基因主要参与光合作用、次生代谢产物的产生、碳同化和植物激素信号传递等过程。与核糖体、ATP 代谢、SA代谢、氧化磷酸化和蛋白酶体相关的通路基因因盐胁迫而下调。

使用WGCNA进行基因共表达网络分析

本研究还进行了WGCNA，以确定共表达的基因簇和核心调控基因，这些基因在SA减轻盐胁迫影响的能力中发挥作用。11,312个DEG被分为11个共表达模块。我们选择了4个与向日葵对盐胁迫和SA的反应相关的模块，解释了模块和样本之间的关系。此外，在黄色模块中识别出93个TF，在蓝色模块中识别出112个TF，在绿色模块中识别出49个TF，在棕色模块中识别出195个TF。这449个TF属于42个家族，其中bHLH、ERF和MYB家族数量最多；这些家族与植物对非生物胁迫的反应密切相关。对这四个模块中的基因进行了功能富集分析，旨在更深入地了解SA处理减轻向日葵盐胁迫引起的损伤的潜在分子机制。黄色模块在真核生物的核糖体生物发生、核糖体和蛋白酶体途径中表现出显着的富集。蓝色模块富集于多种途径，包括磷酸戊糖途径、光合作用、淀粉和蔗糖代谢、光合生物中的碳固定、代谢途径、次生代谢物的生物合成和碳代谢。绿色模块主要富集光合作用、光合作用-天线蛋白、不饱和脂肪酸生物合成和代谢途径等过程。棕色模块主要富集于抗坏血酸和醛糖代谢以及植物激素信号转导。筛选了蓝色模块中主要与碳固定相关的基因、棕色模块中与激素信号转导相关的基因、绿色模块中与光合作用相关的基因、黄色模块中与核糖体相关的基因以及各自模块中的TF来构建共表达网络并识别中心调控基因和转录因子。

叶面喷施一定浓度的外源SA溶液可显着减轻盐胁迫对向日葵幼苗的不利影响。SA可以部分促进盐胁迫下向日葵幼苗的生长和光合作用，导致SA处理后ROS和MDA水平降低。SA增强抗氧化酶活性和AsA-GSH含量，有效减轻ROS积累和膜氧化损伤。DEG在与光合作用-天线蛋白、光合作用、氨基酸代谢和核糖体相关的通路中显著富集。通过K-means聚类和WGCNA鉴定了与盐胁迫响应和减轻其有害影响至关重要的关键基因和TF。SA的有益效果取决于其浓度、生理指标测量和转录组学数据已被广泛研究。总体而言，向日葵在1 mM SA处理下表现最好。我们的研究结果表明，SA有潜力作为生长调节剂，增强向日葵对盐胁迫的反应，这为制定旨在优化盐碱地利用的环境友好且具有成本效益的策略奠定了基础。

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