期刊：ADVANCED SCIENCE
通讯作者：张莎莎、柴人杰
单位：东南大学
影响因子：IF14.3
研究方向：内耳毛细胞再生与保护；耳聋基因致聋机制
小细胞外囊泡（sEVs）是细胞间通讯的重要介质。与体外来源的sEVs相比，组织来源的sEVs可以更准确地反映特定组织释放的体内信号。目前，有关sEVs在耳蜗中的作用的研究主要依赖于体外来源的sEVs。因此，东南大学张莎莎、柴人杰作为共同通讯作者，2024年11月5日在Advanced Science 发表了题为“Isolation and Comprehensive Analysis of Cochlear Tissue-Derived Small Extracellular Vesicles”的研究论文。研究应用小RNA测序、蛋白质组学分析耳蜗组织来源sEV（CDsEV）的miRNA和蛋白质，并且应用单个CDsEV测序和单细胞RNA测序数据的联合分析来追踪CDsEVs的细胞来源。其中单CDsEV-RNA测序和部分数据分析由上海派森诺完成。
Highlight：
①该研究评估了三种耳蜗组织消化方法和CDsEV分离方法，首次提出了使用胶原酶D和DNase І结合蔗糖密度梯度离心分离CDsEVs的最佳方法。
②该研究全面研究了CDsEVs的内容。发现CDsEVs的miRNA和蛋白质对于维持正常的听觉功能至关重要，CDsEVs中的FGFR1可能通过sEVs介导耳蜗毛细胞的存活。
③该研究全面研究了CDsEVs细胞来源。通过单外泌体RNA测序发现不同类型的耳蜗细胞分泌的CDsEVs数量不同，其中Kölliker器细胞和支持细胞分泌最多。
小细胞外囊泡（sEVs）的直径在30–200 nm，可被几乎所有类型的细胞分泌到体液（例如血液、尿液、唾液、泪液和脑脊液）和间质中，对sEVs及其内容物的研究对于阐明细胞间通讯机制和增强临床诊断和治疗具有重要意义。过去几年，组织来源的 sEV（TDsEV）已成为生物医学研究的重点。然而，因为在TDsEV分离过程中会被破裂细胞的细胞囊泡污染，TDsEVs的分离和检测仍然具有挑战性。
传统分离技术超速离心、超滤法、共聚沉淀、免疫磁珠等都会引入更复杂的成分，而传统的检测方法例如TEM，NTA，WB又缺乏外泌体的细胞来源信息（2021，姚波）。本研究提供了针对CDsEVs的分离方法，结合多组学，包括单个细胞层面的高通量检测的思路，为增强对耳蜗中CDsEVs的认识提供了很好的参考。
1.三种耳蜗组织消化方法和CDsEV分离方法评估
考虑到即使是最温和的研磨也不能完全避免细胞内容物的污染，导致提取的CDsEV存在杂质，阻碍了进一步的功能研究，需要建立最优的酶切方法，最大限度地避免细胞损伤，并将CDsEV释放到组织细胞间隙。本研究评估了胶原酶D联合DNase Ι、单独使用胶原酶III和单独使用木瓜蛋白酶的消化效果，以确定消化新生小鼠耳蜗组织的最佳酶。随后采用UC、蔗糖密度梯度超离心（SDGU）和SEC分离CDsEV，并通过对比分析最终选定以3u胶原酶D和40u dna酶Ι消化耳蜗后，SDGU分离CDsEV（图1-图3）。
图1：CDsEV分离、检测流程图
2.小RNA测序分析耳蜗组织来源sEV（CDsEV）的miRNA和蛋白质
通过小RNA测序分析了耳蜗样本和CDsEV两个样本。共检测到550个miRNA，其中两组均有399个（图4A、B），仅在CDsEV或耳蜗组织中存在的miRNA分别有73个和78个（图4C）。GO通路富集分析发现sEV主要来源于核内体、早期核内体和晚期核内体，参与神经系统发育、囊泡介导的运输、早期核内体到晚期核内体的运输，参与多种重要细胞功能与信号通路（图4G-H）。此外，KEGG分析发现65个CDsEV衍生的miRNA的靶基因参与多种听觉活动信号通路（图4I）。这些结果表明，CDsEV中的miRNA可能在听觉个体发生和成熟过程中起调节作用。
图4.CDsEV的小RNA测序分析
3.蛋白质组学探索CDsEV的蛋白质组成和生物学功能
以等量的耳蜗组织蛋白为对照，对CDsEV进行了无标记的定量蛋白质组学分析。每组包括3个生物重复，样品间相关性良好（图5A）。两组共鉴定出4739个蛋白，其中CDsEV鉴定出3040个蛋白，耳蜗组织鉴定出4301个蛋白（图5B）。通路富集分析（图5F-H）表明CDsEV中的蛋白在听力发育过程中积极参与耳蜗形成、HC成熟和突触连接形成的生物学过程，对听觉系统的建立和声音感知具有重要意义。
图5.CDsEV的小RN蛋白质组学分析
4.CDsEV FGFR1的表达和作用
通过WB、OC和SGN (图6A-C)的免疫荧光染色检测P3小鼠耳蜗BM、M和SL中FGFR1的表达。发现FGFR1表达受损会影响HC的存活和细胞凋亡。
图6.CDsEV中FGFR1的表达和作用
5.单sEV-seq数据与耳蜗scRNA-seq数据的联合分析追踪CDsEV的细胞起源
利用10x Genomics测序平台对CDsEV进行了单EV测序分析。通过CB2算法处理后，可以明显区分比细胞小的CDsEV（图7A）。之后，共检测到536个符合条件的sEV（图7B）。降维聚类为8个细胞群（图7C）。
为了追踪CDsEV的细胞起源，进一步将单个CDsEV-seq数据与耳蜗的scRNA-seq数据（GSE135913）整合，分为8个细胞群，每个细胞群都包含sev和耳蜗细胞，这表明CDsEV起源于许多不同的细胞类型（图7E，F）。在8个细胞群中，SC簇中sEV的比例最高（38%，图7G），这表明SC中每个细胞分泌的sEV数量最高。就每个细胞群中sEV的总数而言，SCs和Kölliker’s organ （KO）细胞中sEV的含量最高，这表明SCs和KOs比其他细胞群分泌更多的sEV（SCs和KOs中分别有161和158个sEV，图7H）。这些结果表明，SCs和KOs具有最强大的CDsEV分泌能力，是CDsEV的主要来源。
图7.单个CDsEV转录组与耳蜗scRNA-seq联合分析
原文链接：Isolation and Comprehensive Analysis of Cochlear Tissue‐Derived Small Extracellular Vesicles - Jiang - Advanced Science - Wiley Online Library
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