超级干货 | 蛋白免疫印迹（Western blot，WB）常见问题及对应解决方案

样本处理

1、蛋白样本获取

针对不同样本类型：如细胞样本、组织样本

贴壁细胞：根据细胞量加入适量RIPA裂解液，使用细胞刮、移液器等工具使其充分裂解，收集裂解后蛋白

悬浮细胞：收集悬浮细胞后，离心沉淀并使用RIPA裂解液进行蛋白裂解，过程中也需使用移液器吹打使裂解更充分

组织样本：取适量充分剪碎的组织样本，加入RIPA裂解液，必须进行研磨、匀浆、超声处理，蛋白质溶解度会更好，最后再通过充分离心获取目的蛋白样本。

2、提高蛋白样本质量

可以结合涡旋震荡、超声、匀浆等物理方法，配合去垢剂裂解。同时在提取不同类型的蛋白样本时要评估不同的提取手段，明确蛋白质的类型（如总蛋白、膜蛋白、胞浆蛋白、核蛋白）及其所在位置，考虑蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的类型，目前市面上针对不同的蛋白质类型均有其对应的提取试剂盒，大家可根据自己实验目的选择具体的蛋白提取类型试剂盒。

3、目的蛋白未提取到

实验结果显影时未见条带，可能原因：细胞中并不表达这种蛋白质，换一种细胞或通过查阅文献明确；细胞中的蛋白质降解，需要加入PMSF，抑制蛋白酶活性；抗体不能识别目的蛋白，检查抗体说明书，看是否有问题。

4、细胞提取液时而清亮、时而有沉淀

沉淀可能因为蛋白未变性完全，可适当提高SDS的浓度，同时将样品煮沸时间延长，通常条件为：96℃以上10-15min左右；也可能是抗原浓度过高，可再加入适量上样缓冲液。

5、磷酸化蛋白和总蛋白提取注意事项

操作过程必须全程低温，尽可能冰上操作；裂解液中必须包含蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂，以防止内源性蛋白磷酸酶催化磷酸化蛋白的去磷酸化；为了准确评估磷酸化水平的变化，需要设置两个内参，一个是磷酸化蛋白对应的总蛋白，另一个是普通内参如actin或gapdh，作为体系的对照，确保上样量一致。

6、蛋白定量方法选择

通常包含比色法（Bradford法、BCA法）和紫外法（利用蛋白质分子中酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，使蛋白质具有吸收紫外光的性质。通过测量特定波长下的吸光度，可以测定蛋白质浓度）。实验室使用较多的通常为BCA测定法。

7、蛋白变性、样本保存

根据上样缓冲液是否具有变性作用分为变性蛋白上样缓冲液和非变性蛋白上样缓冲液。WB实验、SDS-PAGE凝胶电泳常用为变性蛋白上样缓冲液，非变性蛋白上样缓冲液仅适用于天然蛋白的研究分析。市面上常见的变性蛋白上样缓冲液根据使用比例可分为：1×、2×、4×、5×几种，根据还原剂的不同变性蛋白上样缓冲液一般分为β-ME款、DTT款、TCEP款，目前科研端使用最多的产品为DTT款、TCEP款。

SDS-PAGE凝胶电泳

1、不同大小蛋白量如何选择凝胶

不同浓度的凝胶适用于分离的蛋白分子量范围不同，注意高浓度的凝胶适用于小分子量蛋白的分离，低浓度的凝胶则适用于分离分子量较大的蛋白。具体分离大小为：6%(50-150KD)、8%(30-90KD)、10%(20-80KD)、12%(12-60KD)、15%(10-40KD)、20%＜10KD。

2、凝胶配制过程注意事项

制胶之前，配胶溶液及缓冲液平衡到室温（室温放置几分钟），可有效避免凝胶中气泡的形成；胶液混匀时尽量避免大力剧烈吹打震荡，大力吹打容易造成胶液中混进空气，同时SDS经过剧烈震荡会产生泡沫，也会导致产气泡产生，混匀时注意轻柔晃动或用移液器轻柔吹打即可，吹打过程中枪尖注意不要离开液面，必要时可以超声震荡排气；胶液灌注的时候注意轻柔匀速、让胶液顺着玻璃板自由流下，一定要避免暴力冲击产生气泡；灌胶完毕后可使用蒸馏水或无水乙醇进行胶面压平。

3、凝胶异常情况

凝胶无法凝固，可能由于APS失效，或TEMED失效、胶未凝固被晃动；胶凝得不均匀：可能玻璃板清洗不彻底，表面有灰尘等杂质；试剂有沉淀、没混匀、APS变质等；拔梳子后泳道有胶丝：TEMED的量太多导致胶凝得太快，插梳子之前胶已经部分凝固；凝胶配置前需充分检查所有配置材料是否新鲜，无异常。

4、电泳时条带变形、条带分离速度过慢

多见于电泳槽漏液，需要注意电泳槽内槽电泳液需要全程保持满溢状态，可事先安装好电泳装置进行检漏，取两个干净的玻璃板（一个短板-带凹槽，一个长板），将两块板对齐，放在制胶主体上，再用楔形板卡紧，两侧一致。然后放到制胶器上夹紧，然后用移液器在两侧玻璃板间加水后静置10min，查看是否漏液。

5、不规则条带（如上宽下窄呈梯形）

可能由于：电压条件不稳，电压设置过高、电泳时间过长，可进行适当调整；蛋白上样量过多，可通过减少上样体积，或改用厚度更宽的凝胶。

转膜和封闭

1、不同的转膜方式差异

主要有湿转法：操作相对复杂，但适应广泛，对温度的控制较好，不容易出错。湿转适用于分子量较大的蛋白。半干转法：操作要求高，但效率也高，耗时短，它适用于分子量较小的蛋白，且所需缓冲液较少。另外，半干转过程中容易产热，需要注意降温。

2、转膜过程中膜的选择

常用的转印膜主要是PVDF膜、NC膜这2种，NC膜对蛋白有很强的结合能力，不需要甲醛预处理，适用于各种显色方法，包括同位素，化学发光、常规显色、染色和荧光显色；背景低，信噪比高，易封闭，也不需要特别严谨的清洗条件。转移到NC膜上的蛋白在合适的条件下可以稳定保存很长时间，但是注意纯的NC膜比较脆，容易卷，不适合用于需要多次重复清洗，选择合适的孔径，随着膜孔径的不断减小，膜对低分子量蛋白的结合就越牢固。通常20KD以上的大分子蛋白用0.45um孔径的膜，小于20KD的建议选择0.2um的，小于7KD的最好选择0.1um的膜，由于NC膜上结合的蛋白会因为一些去污剂而被代替，因此在封闭时最好使用较温和的Tween-20，且浓度不要超过0.3%

PVDF膜具有良好的蛋白质截留能力，机械强度和化学相容性上都更优越的性能。NC膜的典型结合量是80-100μg/cm²，而PVDF膜结合量是100-200μg/cm²(结合强度PVDF比NC膜强6倍)。PVDF膜非常适合于低分子量蛋白的检测。另外PVDF膜具有更好的机械强度和化学耐受性可以反复清洗。不过PVDF膜需要用100%甲醇浸泡(不超过15s)活化。

3、小分子蛋白转膜

由于SDS妨碍蛋白与膜的结合，可去除缓冲液中的SDS，对于20 kDa以下小分子量蛋白，建议使用孔径更小的0.22 μm PVDF膜，转膜条件为200 mA，20-25 min或300 mA，15-20 min，还可以增加甲醇（可用乙醇替代）含量至25%以加强对凝胶里小分子蛋白的固定作用，对于常规中小分子量蛋白（25-70 kDa），可选用孔径0.45 μm的膜，转膜缓冲液中甲醇浓度20%，建议转膜条件为300 mA，30 min左右。

4、大分子蛋白转膜

对于分子量特别大的蛋白，可以选择延长转膜时间，建议转膜条件为300 mA，60-90 min或更长；也可以通过调整SDS浓度，在转膜液中加入适量SDS至终浓度0.5%左右，以加强蛋白从凝胶中的释放；转膜缓冲液中甲醇浓度降到10%或更低，有助于防止蛋白沉淀；最后还可以选择用4℃湿转低电流过夜。

5、转膜操作细节

滤纸和膜剪裁需戴干净手套，避免污染目标蛋白；剪裁滤纸大小需要适中，避免上下两层滤纸互相接触导致短路情况，当使用半干法转膜时，过多的滤纸部分会阻碍电流穿过膜；膜的方向确定: 转移后剪角做标记，分清正反面；用铅笔做记号或电泳时Marker上成非对称的；转膜装置安装好后需要确保凝胶/膜/滤纸间无气泡，否则会导致转膜失败。

6、封闭液选择

脱脂奶粉：最便宜常见的封闭剂，通常封闭液的浓度为 2.5-5% （w/v），容易产生较高的背景信号。

牛血清白蛋白(BSA)：牛血清白蛋白是从牛血清中提纯之后的一种球蛋白，是除了脱脂奶粉之外，常用的封闭剂。通常含有BSA的封闭液的浓度为2-5%（w/v）。

血清：血清如胎牛血清FBS含有大量的蛋白质，可以用于封闭，但是容易产生非特异性背景信号，在WB实验中血清一般用的较少，它更多地应用于免疫组化和免疫荧光实验中样本的封闭。

鱼皮明胶：明胶是胶原蛋白的产物，从冷水鱼皮肤中提取出来的明胶即使在低温情况下也不会凝固，通常使用浓度为0.1-5 % (w/v)。鱼胶含有内源生物素，因此不适用于生物素标记的抗体系统。

聚乙烯吡咯烷酮PVP：聚乙烯吡咯烷酮PVP是传统封闭液的非蛋白质性质的替代品。通常使用的浓度在0.5-2%（w/v），而且通常会和其他封闭剂一起使用。PVP在用于检测较小目标蛋白的时候非常效。

封闭液：商品化封闭液通常含有提纯过的蛋白，用这个封闭液的好处就是你可以确定里面不含有磷蛋白、免疫球蛋白、白蛋白、生物素等其他封闭液中难以避免的成分。

抗体反应

1、抗体的选择

选择抗体可以从以下几个角度：文献引用：根据官网了解该抗体发表文献的数量，如果发现该靶点的抗体有多个货号，那么尽可能选择发表文献较多的货号。反应性：根据自己实验动物的种属性选择合适的抗体，比如，实验动物是小鼠，那么一抗需要选择抗小鼠。实验应用：根据自己实验类型选择厂家验证过的抗体，尽可能选择的抗体能够满足多种类型实验，保证抗体的使用价值。抗体偶联物：标签结合在抗体上使抗体的结合可见，选择标签抗体以检测方法的为依据进行选择。一般推荐使用HRP标记二抗，不建议使用碱性磷酸酶(AP)标记二抗，因其不够灵敏。在二抗种类的选择上，二抗应来源于产生一抗的物种。

2、抗体稀释

按照抗体说明书建议的稀释倍数进行稀释使用，有时一抗和二抗的最佳浓度也取决于检测试剂的灵敏度。一般来说，高倍稀释一抗可减少非特异性信号，高倍稀释酶标二抗可最大限度降低整体的高背景。

蛋白质显影及数据分析

1、显影未见目的条带

可能原因：如果 marker 正常，其他位置没有条带a、抗体无特异性，即抗体不合适；b、可能是一抗或二抗的种属弄错了，比如鼠的加成兔的。

解决方案：

(1)靶蛋白完全无信号，但内参是正常的，大部分情况是一抗抗体失效或用错二抗种属；

(2)靶蛋白和内参均无信号，则考虑是否发光液失效；

(3)如果膜上没有 marker 则为转膜失败；

(4)如果中间出现了细微条带，可能是蛋白上样量太少，或一抗浓度过低。出现这种情况的概率是非常小的，图3展示没有任何蛋白印迹信号，大概率是抗体加错了；如果中间出现微弱的条带，可能是蛋白上样量太少(因为有的蛋白表达本来就很少，对于这种情况可以增加蛋白上样量)，或一抗浓度过低，也有可能是ECL 发光液失效。

2、条带粘连在一起

检查用的胶的浓度和靶标蛋白的分子量是否适合；上样量过高，一般上样量20-25ug即可；上样量过少，拔完梳子后，加样孔有残留的胶，拔梳子后一定要用水把残留的胶冲净，但也要注意，水一定要吸干，否则和残留胶一样会导致同样的结果；拔梳子时不要左右摇动，避免破坏加样孔底部；上样要迅速，否则会引起样品扩散；上样与跑电泳之间的间隔太长,尽量缩短时间间隔；电泳的电压太高，发热导致扩散；降低一抗浓度。可以适当缩短曝光时间；10%APS现配现用。

3、目的条带显影正常但是背景高

一抗或二抗问题：降低抗体浓度和孵育温度，避免抗体和封闭剂的非特异性结合(磷酸化抗体和牛奶)

封闭不完全：BSA换成5%脱脂奶粉，提高牛奶浓度，延长封闭时间

洗涤不充分(非特异性结合没有被完全洗掉)：提高洗涤次数，提高吐温20浓度

曝光时间过长(条带过黑过粗)：减少曝光时间，延迟曝光时间膜的选择(当背景还是很高)：NC膜>PVDF膜，相比之下NC膜背景更低

蛋白降解：加入蛋白酶抑制剂(可以翻倍加)，制样冰上操作，用新鲜样本

上样量过多(条带粗1秒曝出)：减少上样量。

4、条带大小不正确

多聚体或蛋白降解，增加还原剂(DTT)，充分变性；

尽量使用新鲜样本：减少冻融次数(反复冻融会导致蛋白降解)，新鲜样本、冻融前加入蛋白酶抑制剂；

目的蛋白有多个亚型存在：查阅文献或在线网站：Uniprot(https://www.uniprot.org/)确认亚型；

多个修饰位点：磷酸化、乙酰化、泛素化、甲基化、糖基化；

Marker 条带有偏移：看内参的条带位置(根据内参的位置判断目的蛋白的位置是否争正确)，更换marker

5、条带不均一、存在污点、气泡

膜上有气泡：轻柔去除膜上气泡，在转膜时尤其注意：设备污染：确保电泳仪清洗干净(遗留蛋白或胶碎片)：孵育或洗涤时溶液不足：确保在抗体孵育和洗涤时膜充分浸润：孵育时震荡不均匀：确保摇床或振荡器均匀摇晃：封闭液(牛奶)：牛奶要混匀，避免颗粒(建议转膜时就配好牛奶)

6、存在非特异性条带

WB使用的一抗产生非特异性结合，该现象大多数情况是因为一抗特异性不好；提取的蛋白样品降解，蛋白酶将靶蛋白分解成若干个不同大小的蛋白，而这些不同大小的蛋白同样可被一抗识别。建议更换一抗；在蛋白提取的时候适当增加添加蛋白酶抑制剂，降低蛋白的降解。

7、条带出现弯曲

弯曲条带可能原因：配制的SDS-PAGE胶体中存在气泡，或其它不溶性杂质，导致SDS-PAGE胶不均不平整。在配制SDS-PAGE时候，务必将配制试剂的容器洗涤干净；如果多次出现这种情况，建议更换新的制胶试剂。

8、条带出现拖尾

一抗浓度太高和孵育时间过长；检测的靶蛋白浓度过高；

a、一般出现这种情况主要在大分子量蛋白检测实验过程中，因为一抗浓度太高，作用时间太长引起的，因此可以调整一抗的浓度；

b、洗涤一抗和二抗的时候严格按照流程来做，建议 5min/5次(当然也可以每次适当延长1-2分钟，或者加入足够的洗涤液体)，不用担心多次洗涤将抗体和蛋白洗掉，因为抗原和抗体的免疫结合是洗不掉的；

c、降低一抗孵育时间和蛋白的上样浓度/总量。

9、条带形状不规则、出现哑铃状条带

哑铃状条带的出现大的可能性就是胶没有配置好，胶凝固后不均一；蛋白样品中含有较多的杂质，离心收集蛋白时候未被离心到底部，和蛋白一起被收集，在电泳过程中杂质沉淀在蛋白印迹孔的中间，靶蛋白被挤到两边(可能较小)；转膜“三明治”未紧贴在一起，转膜滤纸或海绵由于使用消耗，滤纸及海绵变薄，海绵弹性不足。在配制SDS-PAGE时候，务必配置好，完好的SDS-PAGE在拔出梳子的时候，可见每个孔在一条线上，并无凹凸或此轮状；提取蛋白的时候务必保证蛋白提取质量的纯度和完整性：及时更换滤纸，或者在制作“三明治”的时候，保证“三明治”的是紧贴在一起的。