引言
免疫系统的复杂性和多样性使得在单细胞水平研究免疫细胞的功能和特性至关重要。单细胞免疫组库测序（5’scRNA + TCR/BCR）技术是一种能够在单细胞层面同时解析细胞转录组信息和 T 细胞受体（TCR）、B 细胞受体（BCR）基因重排情况的前沿技术，这项技术为深入理解免疫细胞的发育、分化、抗原识别机制等提供了可能。在疾病研究中，无论是感染性疾病、自身免疫病还是肿瘤，它都像是一把精准的钥匙，帮助我们开启探索免疫反应奥秘的大门，为诊断、治疗和疫苗研发等应用领域带来全新视角。
一、数据来源背景介绍
在机体免疫系统中 T 细胞受体（TCR）和 B 细胞受体（BCR）的序列多样性的总和被定义为免疫组库。TCR\BCR具有抗原识别能力的高度可变区域CDR3区分布在mRNA的5端，TCR的CDR3区包括α链V、J基因片段和和β链V、D、J基因片段，BCR的CDR3区包括轻链V、J基因片段和重链V、D、J基因片段，V（D）J 基因基因重排或重组构成了免疫组库序列的多样性。
单细胞免疫组库测序（5’scRNA + TCR/BCR）是以 10x Genomics 平台的液滴微流控技术为基础在单个细胞层面同时对转录组基因表达情况和 TCR/BCR 序列多样性进行检测的测序技术，最终，可以获得两个数据文库，分别是单细胞 5 端基因表达文库和免疫组库（V (D) J 文库）。
单细胞免疫组库测序
二、数据分析流程
数据下机后后我们会对数据进行进一步质控过滤，进行细胞类型鉴定和克隆型分析，解析免疫细胞异质性和克隆型多样性。
单细胞免疫组库测序数据分析流程
三、数据分析思路
单细胞免疫组库数据分析的核心思路就是筛选目标细胞亚型及克隆型，解析免疫细胞的异质性、细胞亚型的分化转移状态、克隆型多样性等。
单细胞免疫组库测序数据分析思路
1）鉴定细胞类型和克隆型
对细胞进行聚类分群和细胞注释，构建组织细胞图谱，鉴定免疫细胞类型及不同细胞亚群，解析细胞的异质性及免疫特征。对多种克隆型进行分型和注释鉴定，解析CDR3序列特征和V（D）J基因特征，将具有相同或相似抗原识别能力（具有相同 TCR/BCR 序列）的免疫细胞归为同一克隆型（Clonotype），从而了解免疫细胞群体的克隆结构。
分析方法：细胞大类注释、CDR3序列特征分析、V（D）J基因特征分析、TopN 克隆展示（筛选关注频率高的克隆型）。
细胞图谱
CDR3长度分布图
VJ基因使用分布
TopN 克隆型在 UMAP 中的映射图
2）免疫细胞亚群克隆扩增差异分析
为了揭示细胞亚型的TCR\BCR克隆多样性，先对T\B细胞进行再分群分析，鉴定不同的亚型细胞异质性和功能，通过对基因表达数据的分析和组间差异分析筛选出目标免疫细胞亚型，对目标细胞群统计该细胞中的抗原受体克隆多样性及克隆型扩增频率，同时筛选潜在的V（D）J基因。例如，发现某些细胞亚型具有独特的克隆型分布，这可能与它们在免疫反应中的特殊功能相关。
分析方法：细胞亚群细分、组间差异分析、免疫细胞各亚群 clonetype频数分布（解析不同细胞亚型的克隆扩增情况）、免疫细胞亚型V（D）J基因 Usage 热图（分析不同免疫细胞亚型中V（D）J基因的使用情况）。
细胞亚群细分
细胞亚群组间占比分析
克隆型频数
V（D）J基因 Usage 热图[1]
3）克隆型差异基因分析
对已鉴定的免疫细胞进行再分群分析，基于克隆型分型，通过分析不同克隆型亚型的特征基因，揭示每个克隆型独特的基因表达模式，进行功能富集分析，解析具有不同克隆型的免疫细胞激活分化功能机制。对细胞亚群或样本进行共享克隆型和差异克隆型分析，查看相同亚群或不同样本中的共享或差异克隆型分布，找出免疫细胞亚型在不同样本中对应的克隆型，探究clonetype 在不同样本-细胞类型-分组之间的动态变化关系，对关心的克隆型进行亚群间的差异基因分析，筛选挖掘与疾病或其他免疫性状相关的候选基因及其对应的受体基因。
分析方法：免疫细胞亚型共享克隆型分析、样本间共享克隆型分析、克隆型动态变化分析、功能富集分析。
细胞亚群间共享克隆型分析[2]
多样本间独有及共享克隆型分布[3]
克隆型（可选择某一组 topN 克隆型）样本间变化桑基图[4]
4）免疫细胞亚群分化转移分析
根据研究目的筛选出目标免疫细胞亚型，通过功能富集分析研究亚型的细胞功能，最终筛选出具有克隆型扩张程度较强的亚型。利用拟时分析对目标亚型构建细胞轨迹，解析亚型细胞的转移状态，在每个轨迹中提取具有相同克隆型的细胞，使用 RNA 速率和拟时分析研究不同轨迹的方向性，从而最终确定它们的转移方向和过程中的细胞状态，了解免疫细胞在免疫反应过程中的动态变化，以及这些变化与 TCR/BCR 克隆型变化之间的关系。
分析方法：功能富集分析、拟时分析、 RNA 速率分析
GO\KEGG功能富集分析
拟时序轨迹分析
RNA速率分析[2]
四、应用案例思路
案例1：构建免疫细胞图谱
题目：A blueprint for tumor-infiltrating B cells across human cancers
中文题目：人类癌症中肿瘤浸润B细胞的蓝图
期刊：Science
影响因子：44.5
研究背景：
在肿瘤免疫过程中，肿瘤浸润性B细胞在肿瘤免疫过程中扮演着重要的角色。这些B细胞表现出多种功能，主要是通过它们分化为浆细胞产生抗体的能力，但在不同的癌症类型中，它们在时空上存在差异。解剖不同癌症类型中B细胞的丰度和分化状态有望改善免疫治疗反应。
研究思路：
研究结论：
1. 该研究绘制了跨20种人类癌症的肿瘤浸润B细胞蓝图，揭示其异质性及两条动态分化途径，为后续研究提供基础参考。
2. 发现肿瘤中存在生发中心（GC）和非生发中心（EF）两条ASC分化途径，且不同癌症类型对二者有偏好，EF途径主导的癌症与不良临床结果相关。
3. 明确了调控B细胞分化的转录因子及表观遗传网络，不同途径相关的B细胞亚群有特定的调控模式和表观遗传特征。
4. 表明EF途径中的AtM B细胞具有耗竭和旁观者表型，独立于GC途径发育，在空间上与T细胞相互作用，对T细胞功能有影响。
5. 证实谷氨酰胺代谢通过影响表观遗传修饰建立AtM B细胞的身份，且EF途径相关的B细胞与免疫抑制微环境和不良预后相关，为B细胞靶向免疫疗法提供思路。
案例2：肿瘤免疫机制研究
题目：Molecular Pathways of Colon Inflammation Induced by Cancer Immunotherapy
中文题目：癌症免疫疗法诱导结肠炎症的分子途径
期刊：Cell.
影响因子：45.5
研究背景：
靶向CTLA-4或PD-1/PD-L1通路的单克隆抗体—免疫检查点抑制剂（CPI）治疗可在多种人类恶性肿瘤中诱导持久反应，但也会诱导炎症毒性，统称为免疫相关不良事件（irAEs）。然而，导致这些严重炎症副作用的免疫机制仍然知之甚少。
研究思路：
研究结论：
1. CPI结肠炎患者免疫细胞组成改变，CD8 T细胞毒性与增殖增强，CD4 T细胞亚群变化且Tregs未耗竭，髓系细胞频率增加且基因表达改变。
2. 结肠炎相关CD8 T细胞簇与组织驻留记忆T细胞簇在TCR克隆型上存在动态联系，提示分化轨迹。
3. 相关T细胞簇中抑制性受体及细胞因子相关基因表达变化，体现免疫细胞功能状态及IFNγ的重要作用。
4. 发现多个潜在治疗靶点，如趋化因子相关分子和细胞因子等，为CPI结肠炎治疗提供方向。
案例3：抗体筛选
题目：Potent Neutralizing Antibodies against SARS-CoV-2 Identified by High-Throughput Single-Cell Sequencing of Convalescent Patients' B Cells
中文题目：通过对恢复期患者 B 细胞进行高通量单细胞测序鉴定出针对 SARS-CoV-2 的强效中和抗体
期刊：Cell
影响因子：45.5
研究背景：
COVID - 19 大流行急需有效的治疗和预防干预措施。SARS - CoV - 2 的刺突（S）糖蛋白介导病毒进入宿主细胞，其受体结合域（RBD）与宿主细胞的 ACE2 受体结合。康复患者血浆中的中和抗体对治疗 COVID - 19 有一定效果，但血浆大规模生产受限。从康复患者记忆 B 细胞中分离中和性单克隆抗体（mAbs）具有治疗潜力，但传统筛选方法耗时费力。本研究旨在应用高通量单细胞 RNA 和 VDJ 测序技术，快速高效地从康复患者中鉴定 SARS - CoV - 2 中和抗体。
研究思路：
研究结论：
1. 运用高通量单细胞测序技术，从COVID - 19康复患者中鉴定出14种强效SARS - CoV - 2中和抗体，其中BD - 368 - 2效力最强。
2. BD - 368 - 2在hACE2转基因小鼠模型中展现出高治疗和预防功效，能改善感染小鼠生理状况并降低病毒载量。
3. 解析中和抗体BD - 23 - Fab与S三聚体刺突蛋白的结构，发现其通过竞争抑制ACE2 - RBD结合来中和病毒，为筛选提供参考。
4. 基于CDR3H结构相似性筛选出部分中和抗体，提示可能存在针对SARS - CoV - 2特定表位的刻板型B细胞受体，为抗体疗法提供思路。
参考文献：
[1] Yang H Q , Wang Y S , Zhai K ,et al.Single-Cell TCR Sequencing Reveals the Dynamics of T Cell Repertoire Profiling During Pneumocystis Infection[J].Frontiers in Microbiology, 2021, 12:637500-.DOI:10.3389/fmicb.2021.637500.
[2]Luoma AM, Suo S, Williams HL, et al. Molecular Pathways of Colon Inflammation Induced by Cancer Immunotherapy. Cell. 2020;182(3):655-671.e22. doi:10.1016/j.cell.2020.06.001.
[3]Wang P,Jin X,Zhou W,et al.Comprehensive analysis of TCR repertoire in COVID-19 using single cell sequencing[J].Genomics, 2020, 113(2).DOI:10.1016/j.ygeno.2020.12.036.
[4]Borcherding N , Vishwakarma A , Voigt A P ,et al.Mapping the immune environment in clear cell renal carcinoma by single-cell genomics[J].Communications Biology, 2021, 4(122).DOI:10.1038/s42003-020-01625-6
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END
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