表观基因组学是研究基因表达调控的重要领域。近年来，随着单细胞测序技术的发展，科学家们能够更深入地探讨细胞在不同条件下的基因表达及表观基因组变化。特别是在癌症研究中，了解药物如何影响肿瘤细胞的基因组和表观基因组，对开发有效的治疗方法至关重要。
在癌症研究中，表观遗传修饰，如组蛋白修饰和染色质可及性，发挥着关键作用，影响肿瘤的发生与发展。许多小分子药物通过改变这些表观遗传标记来抑制肿瘤细胞的生长。例如，BET抑制剂（如JQ1）通过阻止BRD4蛋白与染色质结合，从而抑制肿瘤细胞增殖。然而，单一药物的治疗效果通常有限，且肿瘤细胞易通过多种机制产生耐药性。因此，研究不同小分子药物在单细胞水平上的基因组和表观基因组作用，对于设计更有效的组合疗法至关重要。
2024年7月，北京大学未来技术学院/北京大学-清华大学生命科学联合中心/北京大学肿瘤医院/北京大学成都前沿交叉生物技术研究院何爱彬团队与北京大学国际癌症研究院/北京大学肿瘤医院舒绍坤团队合作在Nature Methods杂志在线发表题为“Single-cell EpiChem jointly measures drug-chromatin binding and multimodal epigenome”的研究论文。该研究提出了一种新的技术——单细胞EpiChem（scEpiChem），能够同时测量小分子药物在单细胞中的基因组结合位点及其对表观基因组的影响。这种方法结合了药物标记和单细胞测序技术，使研究人员能够在高通量水平上分析不同药物与细胞内基因组和表观基因组的相互作用，为理解药物作用机制和开发新的抗癌疗法提供了新的工具。
scEpiChem利用编码的组合拆分和pA-Tn5抗体介导标记来获得单细胞小分子结合位点（如图1）。具体实验流程如下：
（1）轻度固定透化的细胞和生物素化小分子-抗生物素抗体复合物一起孵育；
（2）用6个带有T5条形码接头的protein A-Tn5(PAT-T5)标记细胞，以标记小分子靶向的特定基因组区域；
（3）将具有转座染色质片段的细胞分配到96孔板中，与特定的条形码寡核苷酸进行两轮杂交；
（4）将细胞汇集后进行连接，再重新分配（每孔1000~3000个细胞），用96种条形码寡核苷酸通过PCR进行第四轮加编码；
（5）最后对DNA片段进行扩增和测序。
图1 scEpiChem的技术原理图
1、单细胞EpiChem分析小分子药物的基因组结合位点
首先，研究者验证了该方法的准确性，如图2。通过分析K562和HGC27细胞中JQ1-btn（BET溴结构域蛋白抑制剂JQ1的生物素化衍生物小分子）的聚合和单细胞谱，发现在代表性基因组位点周围与BRD4（BET蛋白）表现出相似的模式，但在两个人类细胞系之间显示出不同的JQ1-btn结合位点。人鼠物种混合实验以验证该方法能得到单细胞的信息，碰撞率为1.2%。来自两种生物素化小分子（JQ1-btn和THZ1-btn）数据集的非重复读取和峰读取分数（FRiP）中也获得了一致的数据质量。表明scEpiChem能以高信噪比对小分子靶向的基因组结合位点进行高通量分析。
图2 小分子药物基因组结合位点的单细胞EpiChem谱分析
2、单细胞EpiChem联合分析小分子药物JQ1的基因组结合与组蛋白修饰或染色质可及性
研究人员进一步展示了scEpiChem的联合分析能力。对K562：HGC27 =1：1的混合细胞系体系中使用JQ1-btn，验证了scEpiChem区分双模态细胞混合物的能力（图3b）。根据5-kb全基因组信号计算相关性发现，JQ1-btn与H3K27me3信号之间存在明显分离，BRD4位点周围聚集单细胞JQ1-btn信号，而JQ1-btn与H3K27me3信号互斥，证实了JQ1-btn的靶标BRD4以高乙酰化组蛋白修饰且缺乏H3K27me3的特征与染色质区域结合。之后研究人员将scATAC-seq引入scEpiChem，证实了scEpiChem在同时检测药物-靶标结合与染色质可及性的能力（图3e-g），并能够识别出药物与靶蛋白结合之间的细微差异。这些研究结果表明，scEpiChem能够成功地同时测量药物靶点结合和染色质结合蛋白/可及性。
图3 scEpiChem 实现小分子JQ1基因组结合和组蛋白修饰或染色质可及性的联合检测
3、单细胞EpiChem鉴定结直肠癌类器官中不同小分子药物的细胞类型特异性基因组结合动态
为了证明单细胞EpiChem在实际应用中的价值，研究者综合多模态分析以揭示多种药物与肿瘤异质性的相互作用。上皮-间质转化(EMT)过程在各种生物现象中起着关键作用，包括胚胎发育和癌症转移。通过构建H3K27ac和三种生物素化小分子（JQ1-btn、THZ1-btn和Dox-btn）在上皮-间质转化（EMT）过程中的单细胞动态基因组结合图谱，确定了上皮细胞和中间EMT细胞两个细胞群（图4a, b）。拟时序分析揭示了结直肠癌（CRC）类器官中存在从上皮细胞到中间EMT细胞的分化轨迹（图4c）。此外，EMT期间JQ1-btn、THZ1-btn和Dox-btn在GPN3上的信号富集（图4d, e）。GO富集分析表明：沿分化轨迹的H3K27ac信号动态变化伴随不同小分子基因组分布及独特的基因功能（图4f）。
图4 scEpiChem鉴定三种小分子药物在人CRC类器官中细胞类型特异性基因组结合动力学
4、单细胞EpiChem动态绘制JQ1-btn基因组结合及其在结直肠癌类器官中BRD4的结合情况
之后，研究者探究了EMT期间药物-靶点结合和表观基因组景观的动态关系，以进一步揭示染色质状态下药物结合位点与其蛋白质靶点之间的复杂关系。研究人员同时进行了CRC类器官的ATAC-seq，鉴定出两个主要群，并进行了拟时序分析（图5a、b）。在中间EMT细胞的VIM位点发现了显著的JQ1-btn、BRD4和ATAC信号，在上皮细胞CDH1位点也有显著信号（图5c）。接着建立了与EMT相关的假定JQ1-BRD4靶向连接（图5d），并将这些连接按照ATAC信号的动态轨迹分为三个簇（图5d）。各簇表现出JQ1-btn与BRD4协同信号的异质性与独特的信号传导通路（图5e, f），表明药物基因组结合和表观基因组景观的调节相互作用。
图5 scEpiChem动态定位JQ1-btn基因组结合及其靶BRD4在人类CRC类器官中的作用
scEpiChem提供了一个全面的高通量分析框架，捕捉了传统bulk分析无法揭示的小分子药物反应的细胞异质性特征。它识别了不同细胞类型在药物-染色质结合与靶蛋白-染色质结合上的细微差异，从而揭示了药物与已知靶标蛋白共享和独特结合位点的特征。在药物耐药性研究中，scEpiChem通过同时映射单细胞中的小分子药物和组蛋白修饰特征，为研究药物与动态表观基因组景观之间的多样化相互作用开辟了新途径，识别出一系列可能参与药物反应的转录因子。这些结果对于设计更有针对性和更有效的治疗策略至关重要，例如组合选定的小分子药物以克服耐药性。
1
END
1
