空间转录组测序技术(ST)能够揭示组织的空间结构和分子特征，对于理解包括胚胎发生、器官发生和肿瘤微环境在内的许多基本生物学过程至关重要。然而，集成成本效益、高吞吐量、广泛的视野和与三维（3D）体积的兼容性一直是一个挑战。微流控技术在ST领域显示出巨大的潜力，它具有高性价比和多组学应用的适应性。然而，现有的微流控空间转录组方法在处理大量样本、捕获区域大小以及分辨率和视野之间的权衡等方面存在挑战，限制了其在复杂组织中的应用。
2024年9月10日，中国科学院动物研究所的赵方庆团队在Nature Genetics发表了题为Custom microfluidic chip design enables cost-effective three-dimensional spatiotemporal transcriptomics with a wide field of view的研究论文。这是一种结合了碳二亚胺化学、空间组合索引和创新的微融合设计的新方法。该研究团队通过创新的网格化微流控芯片设计，结合碳二亚胺化学和新的空间编码技术，开发了一种高通量、大视野的空间转录组学新技术（MAGIC-seq）。这项技术不仅显著提高了检测通量和捕获面积，还大幅降低了成本和批次效应，为大规模三维组织研究和复杂转录过程的深入分析提供了新的研究途径。
01
在这项研究中开发了一种新型的微流体空间转录组测序技术，命名为MAGIC-seq，以解决现有方法的局限性，并增强微流控技术在复杂组织中的适用性。MAGIC-seq结合了碳二亚胺化学、空间组合索引和创新的微流体设计，能够以更高的灵敏度和可重复性对多种组织类型进行分析，并提供高通量、低成本和大视野的空间转录组测序。
1、微流体芯片设计与制备：根据不同样本的需求，研究中设计了三种不同类型的微流体芯片，包括三格芯片、九格芯片和拼接格芯片，以满足不同样本尺寸和视野的需求。芯片采用AutoCAD软件设计，并使用光刻技术制备硅模具。随后，将聚二甲基硅氧烷(PDMS)浇注在模具上，固化后得到微流控芯片。最后，使用金属冲头在芯片上形成进出口孔。
2、空间条形码DNA阵列的预制备：使用空间组合索引方法在玻璃载玻片上预制备空间条形码DNA阵列。首先，将氨基修饰的条形码X通过EDC/NHS化学反应共价连接到玻璃载玻片上。然后，将第二个微流控芯片垂直放置在第一个芯片上，并将氨基修饰的条形码Y连接到条形码X上，形成具有独特索引的空间条形码DNA阵列。
3、样本制备与测序：将组织切片固定在条形码载玻片上，进行苏木精-伊红 (H&E) 染色和透化处理。释放的mRNA被DNA阵列捕获，并在原位进行逆转录和 cDNA 扩增。构建包含空间条形码、UMI和cDNA插入片段的文库，并进行双端测序并进行数据分析。
图1 MAGIC-seq工作流程概述
02
MAGIC-seq 的性能评估
通过与商业平台 10× Visium V2以及基于微流体的方法DBiT-seq和Decoder-seq在基因计数、测序效率、捕获区域/斑点、通量和成本等方面的比较，系统地评估了MAGIC-seq的性能。在50 μm分辨率的条件下，MAGIC-seq技术仅用149种barcode就能将捕获面积扩展至21.6 mm×21.6 mm的范围。即便在接近单细胞分辨率的高标准下，MAGIC-seq也能够轻松实现约3.5 cm2的捕获区域，这一范围远远超出了绝大多数现有技术的检测能力。为了全面评估MAGIC-seq技术的可靠性和适用性，研究团队在一系列关键组织中进行了广泛测试，包括小鼠的大脑、小脑、心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏等。测试结果表明，MAGIC-seq在检测灵敏度、测序效率和数据一致性方面均展现出显著的优越性。
图2 MAGIC-seq能够对多种组织类型进行灵敏、高通量、一致的空间检测
大视野空间转录组分析
设计了一种新型的拼接微流体芯片，通过使用在前两个芯片交叉处对齐的第三个九方形芯片来引入额外的条形码Z来对九个网格进行编码，从而在50 μm的空间分辨率下获得467 mm2的面积，实现了对P3小鼠的大视野空间转录组分析。结果显示，拼接芯片能够有效覆盖整个P3小鼠，并揭示不同组织之间的基因表达差异和空间联系。此外，考虑到网格之间的壁非常薄，使用Cy3和Cy5标记的接头以交错的方式标记九个区域，以监测可能的污染。结果显示在相邻的网格中没有检测到相同的荧光，表明有效分离和保留了条形码的特异性。
图3 MAGIC-seq可以在大视场中对P3鼠标进行空间映射
高分辨率单细胞分析小鼠脑组织
传统的高分辨率空间转录组测序方法通常具有有限的视野，仅能从小鼠组织切片的一部分捕获信息。为了获得大的高分辨率视野，我们将拼接网格芯片提高到近单细胞分辨率（15 μm），覆盖6.48 mm×6.48 mm的区域。通过更高的分辨率，我们观察到大脑的更精细的结构细节，与50 μm相比，它概括了大脑的解剖形态和标记基因在不同大脑区域的更精确分布。使用单细胞数据对每个斑点中存在的细胞类型进行解卷积后，73%的斑点仅包含一种细胞类型，而22%的斑点包含两种细胞类型。少突胶质细胞、兴奋性神经元、内皮细胞和抑制性神经元占相对较大的比例，与先前文献中记录的解剖结构一致。MAGIC-seq能够揭示更精细的脑组织结构细节，并提供更精确的细胞类型分布和基因表达模式。
图4 MAGIC-seq能够以细胞分辨率对小鼠大脑进行空间映射
小鼠器官发生时空转录组图谱
利用拼接芯片对小鼠在三个关键发育阶段(E17.5、PO、P4)的矢状切片进行了分析，构建了小鼠器官发生的时空转录组图谱。定制芯片的面积为18.6 mm×18.6 mm，包含202500个点，分辨率为20μm。我们分别鉴定了E17.5、P0和P4小鼠的81723、102329和144434个高质量组织斑点，捕获了22000多个基因的表达。无监督的空间约束聚类准确地描绘了与已知组织和器官位置和边界（例如皮肤、肌肉、胸腺、心脏、肺等）相对应的转录组簇。此外，组织特异性基因表达，如Stmn2（神经系统）、Mylpf（肌肉）、Fabp2（胃肠道），验证了该方法的准确性。这些发现揭示了肺泡和不同脑区的形成和分化过程，以及相关的基因表达调控网络。
图5 小鼠器官形成的时空转录组图谱
E18.5小鼠脑三维空间转录组图谱
目前，由于技术限制，只有少数研究深入研究了3D空间转录组。受MAGIC-seq上述优点的启发，研究中创建了整个E18.5小鼠大脑的全面3D分子图谱。为了建立精确的3D坐标并捕获空间分子图谱，对337个切片进行了H&E染色，其中94个切片进行MAGIC-seq工作流程。值得注意的是，所有载玻片（11张载玻片，99个捕获网格）在三天内便可完成制造，成本仅为515美元，与其他空间转录组方法相比具有明显的成本优势。在将空间基因表达数据映射到这些3D坐标上后，研究中成功构建了一个高保真的3D分子脑图谱，共有98192个位点（50μm×50μm），每个位点的中位数为4880个基因。这一图谱不仅展示了小鼠大脑在发育过程中细胞和分子的空间分布，还揭示了组织在不同发育阶段的动态变化，为研究大脑发育和功能提供了宝贵的资源。
图6 E18.5小鼠大脑的三维转录组图谱
03
该研究首次提出了“拼接芯片”的创新概念，通过调整网格间距和运用多轮编码技术，将多个捕获网格有效地拼接在一起，从而在不牺牲分辨率的前提下，显著扩展了视野。即便在接近单细胞分辨率下，也能够轻松实现约3.5 cm²的捕获面积，超越绝大多数现有技术的检测能力。综上，MAGIC-seq以其创新和灵活的设计，以及显著的技术优势，重塑了空间转录组学的技术框架。随着技术的进一步优化，MAGIC-seq有望成为推动空间转录组学研究和应用的重要工具，并在更广泛的研究领域中发挥重要作用。
1
END
1
