文章题目
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Microenvironment-responsive metal-phenolic network release platform with ROS scavenging, anti-pyroptosis, and ECM regeneration for intervertebral disc degeneration
技术手段
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RNA-seq、SEM、免疫荧光、qPCR、Western Blot等
中南大学湘雅三医院在国际权威学术期刊《Bioactive Materials》发表了关具有ROS清除、抗焦亡和ECM再生的微环境响应型金属酚网络释放平台用于椎间盘退变治疗研究的相关文章，在IVDD大鼠模型中，TMP@Alg-PBA/PVA通过减缓疾病进展表现出优异的治疗效果，解释了该平台具有治疗IVDD的临床潜力。本研究中转录组测序及部分分析均由上海派森诺生物科技股份有限公司完成。
研究背景
椎间盘退变(IVDD)可由衰老、损伤和遗传因素引起。与IVDD相关的病理变化包括活性氧(ROS)的过度积累、细胞焦亡和细胞外基质(ECM)降解。尽管目前临床上有很多新技术用来治疗和缓解IVDD带来的症状，但是这些方法都是治标不治本。该研究提供了TMP@Alg-PBA/PVA通过按需释放NPs清除ROS、抑制细胞焦亡和减少ECM降解来协同治疗IVDD的临床潜力的证据。
技术路线
研究内容
1.IVDD组织标本病理变化的观察
我们研究了椎间盘退变（IVDD）的病理变化，发现随着退变进展，髓核组织脱水加剧，T2加权MRI信号减弱，椎间隙变窄或消失。红O-快绿染色和HE染色显示细胞数量减少、ECM紊乱及纤维化增加。免疫组化和半定量分析表明，高Pfirrmann分级的退变IVD组织中II型胶原和聚集蛋白表达显著降低，提示水分丧失和纤维化病变。焦亡相关蛋白NLRP3炎性小体、caspase-1和IL-1β在V级和IV级退变组织中表达较高，而在III级中最低，表明焦亡促进IVDD进展。活性氧（ROS）与焦亡和ECM降解密切相关，在IVDD发展中起重要作用，清除ROS对治疗IVDD至关重要。
图1 临床退行性IVD标本的病理改变
2.TMP NPs的表征
通过Mn²⁺与单宁酸（TA）自组装，构建了TA-Mn（TM）配合的金属多酚网络，并用PVP修饰TM表面，得到稳定的TMP NPs溶液。FTIR验证了合成结果，热重分析显示TMP NPs中有机组分含量超过73.2%，表明高药物负载。全扫描光谱证实TMP NPs主要由碳、氧、氮和锰组成。合成的TMP金属多酚网络具有低Mn²⁺浓度，降低了潜在的金属毒性。研究表明，Mn²⁺释放可加速胶原循环和ECM重塑。综上，TMP合成具有低毒性、高载药量、在多种溶液环境下稳定且药物降解慢。
图2 TMP NPs的合成与表征
3.TMP NPs清除ROS的活性
研究了TMP NPs的ROS清除能力，使用ABTS和DPPH探针检测发现，100 μg/mL TMP NPs可清除超过70%的自由基，表明其具有浓度依赖性的自由基清除能力。•OH和O2•−清除实验也证实TMP NPs能降低这些自由基。细胞实验显示，随着TMP NPs浓度增加，ROS逐步被清除，进一步证实了其强ROS清除能力。JC-1实验表明，NPs还能提高线粒体活性。图3 TMP NPs清除ROS的活性
图3 TMP NPs清除ROS的活性
4.TMP@Alg-PBA/PVA水凝胶释放平台的表征
为防止注射到IVD内的溶液流向周围关键区域，设计了一种微环境响应释放平台，以在退化区域局部释放NPs，并在健康组织中保持稳定，实现按需和有效的药物递送。我们将TMP与PVA混合形成TMP@PVA，加入Alg-PBA快速成凝胶。扫描电镜和能谱分析证实了TMP NPs的成功负载和均匀分布。自愈合实验显示水凝胶可在15分钟内重新连接。降解试验表明，水凝胶对ROS刺激有响应，加入H2O2后NPs累积释放量显著增加。总之，该释放平台有望用于IVD注射。
图4 TMP@Alg-PBA/PVA水凝胶释放平台的表征
5.TMP NPs的细胞摄取、溶酶体逃逸和线粒体积累
纳米颗粒（NPs）的细胞摄取效率对治疗效果至关重要。我们将CY5荧光标记的TMP NPs加载到水凝胶中，发现随着NPs浓度增加，细胞摄取逐渐增加，但超过200 μg/mL后不再显著增加。共培养时间越长，细胞内的荧光强度也逐渐增加，流式细胞仪结果一致。TMP NPs在NPCs中表现出快速摄取和长时间保留，适合即时细胞治疗和长期保护。Mito-tracker荧光标记显示NPs与线粒体有显著正相关关系。总之，NPs被细胞吸收后通过溶酶体逃逸释放到胞浆中，靶向线粒体，促进TMP更有效地清除ROS。
图5 TMP NPs的细胞摄取、溶酶体逃逸和线粒体积累
6.TMP@Alg-PBA/PVA水凝胶释放平台对体外焦亡的影响
我们假设TMP@Alg-PBA/PVA可以抑制细胞焦亡，并进行了研究。使用40 ng/mL IL-1β诱导NPCs焦亡，CCK-8实验显示TMP@Alg-PBA/PVA组的细胞活力显著高于对照组和Gel组。IL-1β处理后，凋亡相关蛋白表达增加，而TMP@Alg-PBA/PVA处理后无显著变化。LDH检测显示，TMP@Alg-PBA/PVA组的LDH水平降低，表明细胞膜破裂减少。SEM观察显示，IL-1β组细胞膜孔洞增多，而治疗组细胞形态保持完整。RT-qPCR、免疫荧光和Western blot分析显示，治疗组中IL-1β、TNF-α及NLRP3、caspase-1、GSDMD-N的表达显著降低。综上所述，TMP@Alg-PBA/PVA有效抑制细胞焦亡。
图6 TMP@Alg-PBA/PVA对焦亡的影响
7.TMP@Alg-PBA/PVA抑制焦亡的潜在机制
尽管已验证TMP@Alg-PBA/PVA水凝胶具有抗焦亡特性，但具体机制尚不清楚。通过高通量mRNA测序，我们发现两组间有2967个差异表达基因（DEGs），其中1472个上调，1495个下调。GO分析显示这些DEGs主要与发育、细胞反应、分化和ECM相关。KEGG通路富集分析显示，TNF信号通路、IL-17信号通路、细胞周期和Toll样受体信号通路在治疗组中被下调，特别是IL-17信号通路显著抑制。Western Blot分析显示，添加IL-17抑制剂后，IL-17/ERK信号通路及其下游焦亡相关蛋白的表达减弱。本研究首次揭示了IL-17/ERK信号通路在IVDD中促进焦亡的作用。在IL-1β处理的NPCs中，IL-17A、MEK、pMEK等蛋白水平升高，而添加抑制剂和TMP@Alg-PBA/PVA后，这些效应被逆转，焦亡减少。综上所述，TMP@Alg-PBA/PVA可能通过抑制NPCs中的IL-17/ERK信号通路来减少细胞焦亡，为IVDD治疗提供了新的潜在靶点。
图7转录组测序及分析
8.TMP@Alg-PBA/PVA治疗后ECM的变化
IVDD的主要特征是水分子丢失、ECM降解、纤维化增加及椎间盘机械损伤。减少ROS积累和细胞焦亡可减轻ECM降解，TMP@Alg-PBA/PVA平台释放的Mn2+可能为NPCs提供局部Mn2+环境，加速胶原蛋白循环，促进ECM重塑。我们利用IL-1β刺激NPCs模拟炎症环境对ECM的影响。结果显示，IL-1β处理后，聚集蛋白和Col-II的荧光强度显著降低，表明IL-1β严重损害了NPCs重塑ECM的能力。RT-qPCR和WB实验显示，TMP@Alg-PBA/PVA处理有效降低了ECM降解酶（如MMP-3和MMP-13）的表达，并恢复了聚集蛋白和Col-II的表达。这些结果表明，TMP@Alg-PBA/PVA平台能有效抵消IL-1β对ECM的有害影响，显示出在IVD修复和再生中的潜力。
图8 炎症环境中TMP@Alg-PBA/PVA对ECM的影响
9.TMP@Alg-PBA/PVA对il -1β诱导的大鼠IVDD模型的影响
为了评估TMP@Alg-PBA/PVA在体内的疗效，我们通过IL-1β诱导大鼠IVDD，并在注射后3天进行干预。我们在IVDD大鼠体内原位注射10 μL的TMP@Alg-PBA/PVA释放平台。4周和8周后，影像学分析显示，PBS组和Gel组的DHI显著下降且骨赘形成增加，表明这两种处理未能有效减轻IVDD。然而，添加含有200 μg/mL TMP NPs的高剂量组和100 μg/mL TMP NPs的低剂量组后，DHI下降速度减缓。高剂量组的效果优于低剂量组，表明该平台对IVDD有显著疗效。MRI显示，高剂量组的髓核含水量增加，进一步证实了TMP@Alg-PBA/PVA在治疗IVDD中的关键作用。
图9 动物实验的影像学评价
10.组织染色和免疫组织化学
我们对IVDD大鼠尾部退变组织进行切片和染色。HE染色显示，PBS组和Gel组出现显著的组织结构丧失、髓核萎缩及纤维化，而高剂量和低剂量TMP@Alg-PBA/PVA组保持了清晰的组织边界和软骨终板形态。番红O-快绿染色显示，PBS组和Gel组髓核减少并伴有纤维化，而TMP@Alg-PBA/PVA组维持了纤维环和髓核的边界。免疫组化结果显示，TMP@Alg-PBA/PVA组中Col-II和聚集蛋白表达显著增加，表明该平台有效减轻ECM降解并维持IVD含水量。
图10 IVDD大鼠尾巴的组织学和免疫组织化学分析
11.TMP@Alg-PBA/PVA在体内治疗IVDD的作用机制
为了评估TMP@Alg-PBA/PVA通过减轻细胞焦亡缓解IVDD的潜力，我们对IVD髓核组织进行了免疫荧光染色。Caspase-1用红色标记，GSDMD用绿色标记。假手术组和高剂量组中这两种蛋白几乎不表达，而低剂量组略有增加，Gel组和PBS组则显著增强，表明焦亡加剧。荧光半定量分析显示，高剂量组由于TMP负载量高，抗焦亡效果更佳。这些结果表明，TMP@Alg-PBA/PVA平台可通过减轻细胞焦亡减缓IVDD进展。
图11 TMP拯救大鼠IVDD的分子机制
结 论
在本研究中，我们开发了多功能且微环境响应的金属酚网络释放平台（TMP@Alg-PBA/PVA），装载的TMP纳米颗粒可按需释放以清除ROS。体外和体内研究表明，该平台能有效靶向线粒体、减少细胞焦亡、抑制ECM降解，并增加IVD含水量。该平台通过抑制IL-17/ERK信号通路，为IVDD治疗提供了一种优秀的抑制焦亡的方法。尽管已有类似平台报道，但TMP@Alg-PBA/PVA具有按需释放和多方面作用的优势，显示出治疗IVDD的潜力，值得进一步临床前研究。
原文索引：https://doi.org/10.1016/j.bioactmat.2024.02.036
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