PCR（Polymerase Chain Reaction，聚合酶链式反应），是一种用于放大扩增特定DNA片段的分子生物学技术，能在生物体外快速、大量地复制目标DNA片段。PCR实验作为生命科学研究不可或缺的基本工具，在医学、农学、食品安全学、环境科学、刑侦等多个领域广泛应用，更是我们生命科学实验室里的科研小白需要掌握的必备技能。PCR实验原理及操作流程看似简单，但内含诸多门道，接下来就让小编带大家一起看看PCR常踩的那些”坑“，以及如何精确”避坑“收获完美PCR条带~
一、基本原理
类似于DNA的天然复制过程。它以拟扩增的DNA分子为模板，以一对分别与模板互补的寡核苷酸片段为引物，在DNA聚合酶的作用下，按照半保留复制的机制沿着模板链延伸直至完成新的DNA合成。重复这一过程，就可以使目的DNA片段得到大量扩增。
二、PCR实验主要步骤
三、PCR常见”雷区“
问题一：拖尾、弥散现象-电泳出现拖尾、涂抹带
可能产生的原因：1、体系配置偏差（酶用量、dNTP、镁离子浓度过高）；2、扩增循环数过多；3、PCR 体系中存在污染；4、电泳槽中电泳缓冲液不净；5、电压不稳定；6、退火时间过长或过短；7、PCR扩增模板不纯（提取残留酒精）；
解决方案：1、减少酶用量或使用特异性高的热启动酶扩增；2、调整扩增循环数；3、调查污染源，清洁和消毒实验环境，更换实验器材重新进行实验；4、更换电泳缓冲液；5观察PCR运行电压情况必要时更换PCR仪；6、调整退火时间，可设计梯度退火时间对照实验，选择最佳；7、模板提取过程中尽量晾干酒精。
问题二：引物二聚体产生、引物设计
可能产生的原因：1、引物设计（引物自身或引物间存在互补序列）；2、引物浓度过高；3、模板量过低；4、退火程序（退火温度过低、退火时间过长）；5、PCR配置体系（镁离子浓度过高）；
解决方案：1、重新设计引物，引物设计最好在模板cDNA保守区，并进行Blast比对；2、调整PCR配置体系中引物浓度，可设置梯度浓度摸索最佳引物浓度；3、提高模板投入量，避免引物没有足够的机会与模板结合，导致它们自我结合以减少失活；4、调整PCR扩增中退火程序，提高退火温度，降低退火时间；5、降低PCR体系中镁离子浓度。
问题三：扩增无条带
可能产生的原因：1、模板问题（模板投入量过低、降解、含有杂质、扩增体系存在抑制物）；2、引物问题（引物降解、投入量过低、引物设计与扩增模板不匹）；3、PCR扩增体系（扩增酶失活、Buffer不匹配、镁离子浓度）；4、反应条件不佳（退火温度过高/过低、延伸时间过短）；
解决方案：1、模板调整（可适当增加模板投入量，提取后模板进行定量后及时保存至-20℃条件避免降解，模板提取过程尽量避免吸取到杂质）；2、可更换新的干粉引物或调整引物投入量，检查扩增引物与模板是否对应匹配；3、检查扩增酶活性，确保DNA聚合酶活性，确保所有反应组分（包括缓冲液、dNTPs等）是新鲜的，摸索镁离子浓度或适当加入 DMSO（小于 0.3%）；4、检查反应条件，针对扩增目标片段设定相应延伸时长，调整循环参数和退火温度。
问题四：非特异性扩增条带
可能产生的原因：1、引物与目标序列不匹；2、PCR扩增体系（扩增酶量、镁离子浓度）；3、反应条件不佳（退火温度、PCR循环数）
解决方案：1、重新设计引物，引物设计最好在模板cDNA保守区，并进行Blast比对；2、调整扩增体系（降低酶量或调换其他类型的扩增酶。降低引物量，适当增加模板量）；3、调整反应条件（提高退火温度、减少扩增循环数、采用二温度点法-93℃变性，65℃左右退火与延伸）。
四、其他影响因素
除了上述实验中最常见的几大重点问题外，其他还有一些影响因素，如：
DNA聚合酶选择：根据实验目的选择合适的 DNA 聚合酶。如：常规短片段（＜5kb）的 PCR 扩增和菌液鉴定，使用Taq酶即可，大于 5Kb 的长片段且实验对保真度的需求不高，可选用 Lamp DNA 聚合酶，实验对保真度要求较高，就需要使用高保真酶，如 Pfu、KOD、Primerstar、Phanta 等；
PCR耗材选择：PCR耗材一般都是聚丙烯（PP）材质，因其为生物学惰性材料，表面不易于粘附生物分子，且具有良好的化学耐性、温度耐受性，可121℃高压灭菌，也可以承受热循环过程中的温度变化，PCR管的体积选择上，优先推荐选用低容管。因为低容反应管有较小的上方空间，可提高热传导率并降低蒸发。同时在加样时，需避免加样过量或过少。过量会导致热传导率下降，溢出及交叉污染，而过少可能会造成样品蒸发损失；
移液枪选择：根据PCR实验中需要添加的试剂量来选择适当量程的移液枪，应尽量选择精度高的移液枪，可以提高PCR实验的效率和准确性；
实验室环境控制：严格按照PCR实验室搭建原则进行分区，使用B2型生物安全柜进行核酸加样，规范PCR产物处理等等。
五、小 结
以上便是PCR实验过程中常常碰到的一些问题以及对应解决方案了，希望能够帮助大家解决实验过程中遇到的棘手难题，助力我们每一位科研人收获自己的完美条带~大家如果在实验过程中碰到了其他问题，也欢迎在评论区进行留言沟通~
最后，上述PCR实验过程中所涉及试剂原料、耗材以及相关仪器设备，派森诺均可提供一站式解决方案~
PCR实验相关试剂、耗材和仪器可洽询当地销售或拨打咨询电话：021-80118168-6720。
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