文章解读
文章题目：Neuropeptide signaling orchestrates T cell differentiation
技术手段：CUT&Tag、ATAC-seq、scRNA-seq、bulk-seq
派森诺生物与浙江大学良渚实验室携手合作，在《Nature》上发表了神经肽信号调控T细胞分化的研究成果，影响因子50.5 。
Part01.
研究背景
TH1细胞通过分泌白细胞介素-2（IL-2）和干扰素-γ（IFNγ）在抵御病毒和细胞内病原体、器官特异性自身免疫疾病的发病机制以及抗肿瘤免疫中起着关键作用。然而，TH细胞亚群之间的失衡可能导致严重疾病的免疫病理学。目前，决定T细胞分化为特定谱系的机制以及促进最佳T细胞分化的调节因子尚未完全了解。
最近的研究表明了神经免疫交叉对话在稳态、感染和过敏性炎症期间对先天免疫细胞的重要性，其中神经肽调节先天免疫反应。反过来，炎症介质也可能调节神经元功能。然而，神经肽是否可以指导T细胞分化或决定感染期间的功能结果尚未得到研究。
Part02.
技术路线
Part03.
研究结果
1.动态的TH1和TH2细胞分化
T辅助细胞关键调节因子的表达动力学显示，细胞因子受体基因在早期上调，关键转录因子在中期诱导，向晚期的转变与效应细胞因子基因的诱导相关（图1a）。主成分分析将体外分化的TH1和TH2细胞的表达谱区分开来（图1b）。
为了表征体内TH1细胞分化，我们在急性LCMV感染8天后对分离的4403个脾脏CD4+T细胞进行了scRNA-seq分析（图1c）。这些细胞分为七个簇，包括TH1细胞、滤泡辅助T（TFH）细胞、滤泡调节性T细胞和Treg细胞、自然杀伤细胞等（图1d，1e）。
图1体外和体内TH1细胞分化过程中的动态转录调控
2.TH1和TH2细胞网络的调节
通过建立TH1/TH2双分化系统，在各自不同的细胞群体中，多个TH1和TH2 细胞特征基因被上调 (Fig. 2a)，scRNA-seq也观察到了三个主要的时间阶段，但从早期到中期的转变比传统体外条件晚约20小时。拟时序分析定义了独特的分支基因，包括TH1和TH2细胞的特征基因，如Gata3、Batf、Tbx21和Stat4，以及潜在的调节因子如Sat1和Ramp3，它们在T细胞分化中的功能尚未被研究（图 2i）。
图2 TH1/TH2双分化系统下TH1独特调节因子的测定
3.IFNγ调节因子的鉴定
为了进一步验证TH1细胞调节因子候选基因的功能，利用CRIPSR-Cas9基因筛选系统进行小鼠T细胞体内和体外分化的基因功能筛选（图 3a），我们根据它们在体外、体外和体内对IFNγ表达的影响对所有117个筛选候选基因进行了排名，确定了2个负调节因子和11个正调节因子，其中Ramp3是排名最高的调节因子之一（图 3c）。
图3 验证TH1细胞调节因子候选物的功能
4.CGRP-RAMP3激活cAMP信号转导
CGRP在TH1细胞分化过程中显著增强了IFNγ的产生，而抑制了TH2细胞中IL-13的表达（图 4a）。体外培养的TH1细胞的RNA-seq分析显示，CGRP处理的细胞中TH1细胞特征显著富集，表明CGRP增强了IFNγ和TH1细胞程序（图4b）。此外，外源性CGRP或ADM增强IFNγ表达的作用在Ramp3−/− T细胞中被消除了（图4c），表明外源性而非内源性CGRP增强CD4+ T细胞中的TH1 细胞分化。用特定药物抑制剂阻断cAMP信号传导会降低IFNγ表达，并消除 CGRP或ADM对TH1细胞分化的诱导作用（图 4f），这些结果表明，CGRP - RAMP3轴通过激活和放大cAMP信号传导在早期增强TH1细胞分化。
图4 CGRP-RAMP3轴通过激活cAMP信号通路增强TH1细胞分化
4.CGRP-RAMP3-cAMP 轴激活 STAT1
为了深入理解CGRP如何诱导TH1细胞程序，我们对经CGRP处理的CD4+ T细胞进行了转录组和ATAC-seq分析。研究发现，在TH1或TH2细胞分化条件下，CGRP诱导的染色质可及性和表达谱发生了变化（图5a）。具体来说，对CGRP的反应中TH1细胞早期调节基因如Il12rb2、Il18r1和Stat1的表达上调（图5b），这些基因位点的染色质可及性也更高（图5c、d）。这表明CGRP通过改变染色质的可及性，促进了TH1细胞的早期调节基因表达，从而促进TH1细胞的分化。
CGRP增加了与IFNγ信号通路相关的基因的染色质可及性，如Irf4、Irf8、Gbp7、Rap1a和Socs1，在TH1和TH2细胞条件下均是如此（图5e）。同时，TH2细胞调节因子Gata3和Il13在CGRP处理后失去了染色质可及性（图5f）。因此，CGRP通过表观遗传重构调节TH细胞亚型分化。
在T细胞中，p-CREB和ATF3都被CGRP诱导（图5g），CREB在Atf3基因启动子的结合位点通过CUT&TAG和ChIP-qPCR检测在T细胞中得到确认（图5i）。CGRP增强的TH1细胞分化和CGRP诱导的Stat1在Atf3缺陷的T细胞中都被取消了（图5j），这表明CGRP通过ATF3诱导Stat1。我们进行了ChIP-qPCR并发现ATF3结合到Stat1的启动子区域（图5k）并诱导Stat1基因表达。最后，CGRP诱导的TH1细胞早期调节因子（Stat4和Il12rb2）在Stat1缺陷细胞中被取消了（图5l）。总的来说，RAMP3-CREB-ATF3通过诱导关键转录因子STAT1来调节TH1细胞分化。
图5 CGRP-RAMP3-cAMP通过表观基因组重塑和STAT1激活增强TH1细胞分化
5.LCMV 感染期间的 CGRP–RAMP3 轴
在感染后第 8 天，我们在 Calca−/−小鼠中检测到脾脏肿大和更高的病毒载量（图 6b）。用 KCl 对脾脏进行体外刺激，在感染LCMV后，CGRP 的释放显著增加（图 6d）。总之，这些结果表明神经元 CGRP 在体内调节TH1细胞分化，并支持神经元与免疫细胞之间的相互作用在促进 TH1 细胞分化和抗病毒免疫中的作用。Ramp3−/−小鼠在稳态下正常，但在 LCMV感染后，TH1和Tc1 细胞的频率降低（图6f），抗原特异性TH1和细胞毒性CD8+ T 细胞反应受损，脾脏肿大（图6h），证实了 RAMP3 在病毒感染期间调节TH1细胞发育中的独特功能。
图6 CGRP-RAMP3轴在LCMV感染期间增强了TH1和TC1细胞的反应
Part04.
结 论
本研究剖析了体外极化过程以及急性病毒感染后体内分化过程中TH1细胞分化的动态调节。利用独特的TH1-TH2双分化培养系统确定了调节T辅助细胞分化的调控因子，并通过多次体外和体内CRISPR筛选系统地验证了其调节功能。研究发现RAMP3（CGRP受体的一个组成部分）在TH1细胞命运决定中具有细胞内在作用。细胞外CGRP通过受体RAMP3-CALCRL发出信号，限制TH2细胞的分化，但通过激活下游的cAMP反应元件结合蛋白（CREB）和激活转录因子3（ATF3）促进TH1细胞分化。ATF3通过诱导Stat1的表达促进TH1细胞分化，Stat1是TH1细胞分化的关键调节因子。病毒感染后，神经元产生的CGRP与T细胞上表达的RAMP3之间的相互作用增强了产生抗病毒干扰素γ的TH1和CD8+ T细胞反应，并及时控制了急性病毒感染。本研究确定了一种神经免疫回路，在急性病毒感染期间，神经元通过产生神经肽CGRP参与T细胞命运决定，CGRP作用于表达RAMP3的T细胞，诱导有效的抗病毒TH1细胞反应。
原文索引：
Hou, Y., Sun, L., LaFleur, M.W. et al. Neuropeptide signalling orchestrates T cell differentiation. Nature (2024). https://doi.org/10.1038/s41586-024-08049-w
产品介绍
表观调控是指序列不发生变化但基因表达却发生了可遗传的改变，即基因型未发生变化而表型却发生了改变。包括DNA甲基化、组蛋白修饰、染色质重塑、非编码RNA等。表观遗传参与调控细胞分化、个体发育、肿瘤发生和发展等众多生物学过程，是一种将环境压力和基因表达联系起来的重要机制。
表观调控产品列表
ChIP-seq
染色质免疫共沉淀技术（Chromatin Immunoprecipitation，ChIP）也称结合位点分析法，是研究体内蛋白质与DNA相互作用的有力工具，通常用于转录因子结合位点或组蛋白特异性修饰位点的研究。将ChIP与二代测序技术相结合的ChIP-Seq技术，能够检测全基因组范围内与组蛋白、转录因子等互作的DNA区段。一般使用新鲜细胞、梯度冻存细胞、新鲜组织或是冰冻组织进行实验，可以广泛应用于哺乳动物的蛋白与DNA互作研究。酵母和植物等生物类型可经由破除细胞壁或者提取细胞核来进行实验。
Peak 与 TSS 距离的分布
Peak 在功能元件上的分布
motif 示意图
CUT&Tag
CUT&Tag（Cleavage Under Targetsand Tagmentation）是蛋白质-DNA互作关系研究的新方法，与传统的ChIP-Seq研究方法相比，该技术无需交联、超声打断、末端抹平和接头连接等操作，因此具有省时高效、所需样品量少、背景信号低和可重复性好等优点。CUT&Tag是ChIP-seq升级版，也适用于无ChIP级别抗体的蛋白质-DNA互作研究。
酶切片段长度分布
功能性区域Peak分布
差异Peak基因富集分析
ATAC-seq
利用高通量测序检测转座酶易接近染色质的技术。在ATAC-seq技术中，DNA探针（作为转座子发挥作用）通过酶促反应（转座酶Tn5）被整合到基因组的开放区域，然后通过测序来鉴定这些区域。其本质也是研究DNA与蛋白质结合的技术。一般用于肿瘤异质性研究、基因调控网络分析、细胞谱系示踪、生物标记物发现等。
Peak中心信号分布图
Peak 在染色体上的分布
Motif分析
全基因组甲基化测序（WGBS）
DNA甲基化对生命活动非常重要，是基因调控的手段之一(即通过对位于启动子及第一外显子区的CpG岛的甲基化而抑制基因的表达)，它在基因表达调控、肿瘤研究、染色质重塑、遗传印记、疾病研究、胚胎发育、环境与表观遗传和表观异质性等方面起至关重要的作用，是表观遗传学研究的热点。适用于所有参考基因组已知物种的甲基化研究。适合项目前期探索性开发，锁定目标区域。
单染色体水平甲基化比例分布
甲基化圈图
DMR区基因富集分析
m6A甲基化
RNA甲基化作为表观遗传学研究的重要内容之一，是指发生在RNA分子上不同位置的甲基化修饰现象，6-甲基腺嘌呤(N6-methyladenosine，m6A)是真核生物中常见的RNA转录后修饰。RNA甲基化在调控基因表达、剪接、RNA编辑、RNA稳定性、控制mRNA寿命和降解等方面可能扮演重要角色。m6A修饰在肥胖、癌症、突触信号传递、精子发育、卵子发生、干细胞分化、减数分裂、昼夜节律等生物学过程发挥重要作用。
peak中心信号分布图
peak比较分析
KEGG功能分析
点击图片查看
1
END
1
