上期与大家分享了有关PCR实验的的常见问题与对应解决方案，本期小编将继续为大家分享，PCR下游实验-载体构建的细节、常见问题及解决方案。
载体构建是分子生物学研究中常见的实验技能，广泛应用于基因表达研究、基因治疗、转基因生物培育和蛋白质生产等领域，其目的是将目标基因（或DNA片段）插入到合适的载体（如质粒、病毒载体等）中，形成重组载体。那么：目标基因如何获取？什么样的载体为合适的载体？目标基因与载体如何连接？载体构建后又如何验证它是否构建成功？等等..........都是大家在实验过程中会遇到的问题~接下来就由小编向大家一一道来：关于载体构建的“小心机”。
基本原理
载体构建主要包括：已有载体多克隆位点（MCS）的改造和已有载体启动子、增强子、筛选标记等功能元件的改造。是为把DNA分子运送到受体细胞中去，必须寻找一种能进入细胞、在装载了外来的DNA片段后仍能照样复制的运载体。常见的运载体是质粒，在基因工程中，常用人工构建的质粒作为载体。载体构建即是构建含外源DNA的质粒。
常见载体分类
载体构建关键步骤
载体构建常见方式分类
酶切连接法：利用限制性内切酶对目的基因和载体进行切割，产生相同或互补的黏性末端或平末端，然后通过DNA连接酶将目的基因和载体连接在一起，是最经典且实验室使用最多的方法学；
同源重组法：基于生物体内同源染色体之间的重组机制。在体外，使目的基因和载体两端具有一定长度（通常20 - 50bp）的同源序列，在重组酶或细胞内自身重组系统的作用下，目的基因和载体发生重组；
Gateway克隆技术：基于λ噬菌体的位点特异性重组系统，需要购买专门的Gateway系统的入门载体和目的载体，以及相应的BP和LR重组酶，实验室不常使用该方法学；
载体构建常见问题总结
目的基因获取
目的基因常见获取方式：PCR基因扩增＆基因文库获取
可能存在的问题：
1、PCR扩增失败；
2、基因文库筛选效率低
解决方案：
1、重新设计引物，确保引物与目的基因序列特异性结合；
2、构建高质量的基因文库，提高文库的覆盖率。另外可优化筛选方法，如采用更灵敏的杂交探针或改进筛选的杂交条件，提高目的基因筛选的准确性和效率。
载体酶切问题
酶切处理：选择合适的限制性内切酶对载体进行切割，酶切反应条件需要严格控制，包括温度、反应时间、酶的用量等
可能存在的问题：
1、酶切不完全（酶用量不足、酶切时间不够、酶活性受抑制）；
2、载体自连（单酶切易出现）
解决方案：
1、增加酶用量但注意不可过量，过量亦会导致抑制现象，延长酶切时间，检查反应温度是否为酶切最佳温度，检查反应体系是否存在酶抑制剂（某些离子成分可能存在抑制性）；
2、酶切后载体进行去磷酸化处理，防止自连，同时推荐最好使用两种不同的限制性内切酶进行双酶切切割载体，可有效降低自连现象。
目的基因与载体连接问题
实验室常用连接方式：黏性末端连接＆平末端连接
可能存在的问题：
1、连接效率低；
2、目的基因与载体发生错误连接
解决方案：
1、针对连接效率低：黏性末端连接，要确保目的基因和载体的黏性末端匹配良好，在连接反应前可对酶切产物进行纯化。平末端连接，可选用高活性的T4 DNA连接酶，同时适当增加连接酶的用量和延长连接反应时间。还可以在连接反应体系中加入一些促进剂，如聚乙二醇（PEG），提高连接效率。
2、注意设计和选择酶切位点，尽量保证目的基因只有一种正确的插入方向。
重组基因筛选与鉴定问题
实验室常用重组基因筛选与鉴定方法：筛选-基于选择标记的筛选＆蓝白班筛选；鉴定-PCR鉴定、酶切鉴定、测序鉴定
可能存在的问题：
1、重组基因假阳性；
2、重组基因鉴定错误
解决方案：
1、针对假阳性可采用多种筛选方法相结合的方式。例如在利用抗药基因筛选后，再进行蓝白斑筛选或其他功能筛选，提高筛选的准确性，同时对筛选出的可疑克隆进行进一步验证，如提取质粒后进行酶切或测序分析；
2、规范操作流程，在进行PCR、酶切和测序操作时，严格按照操作规程进行。对于PCR鉴定，检查引物的正确性和退火温度等条件；对于酶切鉴定，确保酶切体系和条件准确无误；对于测序鉴定，选择质量可靠的测序服务提供商，并对测序结果进行仔细分析。
重组载体导入宿主细胞问题
实验室常用导入方式：转化（针对细菌宿主细胞）＆转染（针对真核细胞）
可能存在的问题：
1、转化/转染效率低；
2、细胞毒性影响
解决方案：
1、优化调整转化/转染方法和条件。对于细菌转化，精确控制热激温度和时间，对于真核细胞转染，可尝试不同的转染试剂和方法，如脂质体转染时，优化脂质体和重组载体的比例，以及细胞的培养状态和密度等。还可以考虑采用电穿孔等其他转染方法，并优化电穿孔参数。
2、筛选低毒高效的转染试剂，可通过预实验对比不同转染试剂对细胞的毒性和转染效率。减少转染试剂的用量，在保证一定转染效率的前提下，尽量降低对细胞的损害。同时，可在转染后及时更换培养基，去除可能残留的转染试剂。
小结
载体构建实验相关试剂、耗材和仪器可洽询当地销售或拨打咨询电话：021-80118168-6720
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