快报 | 曲格列酮通过LKB1-AMPKα信号促进巨噬细胞自噬抑制结核分枝杆菌存活

作者：毕静¹，郭庆龙¹，宫雅琪¹，陈茜¹，吴浩嘉¹，宋丽¹，徐亚廷¹，欧敏¹，王召钦¹，陈杰安²，蒋晨然²，刘爱梅³，李国保¹，张国良¹

作者单位：¹ 深圳市第三人民医院，国家感染性疾病临床医学研究中心；²深圳湾实验室；³广西壮族自治区胸科医院

共同第一作者：毕静，郭庆龙，宫雅琪，陈茜

*通讯作者：张国良

文章来源：

Troglitazone reduces intracellular Mycobacterium tuberculosis survival via macrophage autophagy through LKB1-AMPKα signaling 

Bi J, Guo Q, Gong Y, Chen X, Wu H, Song L, Xu Y, Ou M, Wang Z, Chen J, Jiang C, Liu A, Li G, Zhang G.

J Infect Dis. 2024 Oct 25:jiae523. 

doi: 10.1093/infdis/jiae523. 

Online ahead of print.PMID: 39450555

由结核分枝杆菌（MTB）引起的结核病（TB）在世界范围内造成了显著的发病率和病亡率。包括常规药物在内的宿主定向治疗（HDT）是一种很有前景的抗结核策略，与抗结核药物联合使用时显示出协同抗菌效果。本文研究了三种抗糖尿病药物的抗菌作用。其中，只有曲格列酮（Trog）的体外和体内抑菌作用增强。这是由于Trog介导的自噬激活。此外，敲除实验表明，Trog通过LKB1-AMPK信号通路激活自噬并表现出抗真菌活性。分子对接和共免疫沉淀实验表明，Trog通过靶向STRADA促进LKB1磷酸化和活化。最后，我们发现Trog抑制临床异烟肼（INH）耐药MTB的细胞内存活，并且Trog与INH联合使用对MTB H37Rv具有加性抗菌作用。综上所述，抗糖尿病的Trog可能被重新用作HDT候选药物，并与一线抗结核药物联合使用。

耐药结核病对目前的治疗方案构成重大挑战，开发更有效的抗结核药物和治疗方案是必要的。最近研究集中在一种被称为宿主定向治疗（host-directed therapy，HDT）的新型治疗方法上，它通过靶向宿主因子来增强宿主防御机制或调节宿主先天和适应性免疫反应，以改善治疗效果。HDTs包括具有良好安全性的非传染性疾病的定期用药、免疫调节化合物、生物制剂、营养品和细胞疗法。体外和体内研究表明，HDTs通过改善宿主免疫和病理损伤来改善包括MTB感染在内的各种传染病的预后，因为MTB已被证明可以减弱宿主的先天和适应性反应，并利用免疫病理学来获益。HDTs被认为是克服抗菌素耐药性的标准抗菌素治疗的潜在辅助手段。这些报告表明，HDTs是抗结核治疗的一种有吸引力的策略，特别是对耐药结核病。

HDTs通过诱导自噬等多种机制对宿主免疫发挥调控作用。自噬是一种重要的内在生物过程，在应激条件下，自噬循环并降解受损的细胞成分和细胞器以维持细胞稳态。两种主要的宿主自噬途径可以防御细胞内病原体：xenophagy和LC3-associated phagocytosis （LAP）。将病原体靶向LAP在某些情况下具有抑制作用，但在其他情况下有助于细菌存活。先前的研究表明，LAP不能促进MTB在小鼠巨噬细胞中的抑制，靶向MTB进行异种自噬是成功的，因为它的限制。然而，MTB通过多种机制破坏宿主自噬，克服细菌抑制可能是药物开发的成功途径。自噬相关的HDTs已被证明有助于宿主消除MTB感染。诱导自噬可增强吞噬酶体融合，改善抗原呈递，减少炎症。雷帕霉素是哺乳动物靶雷帕霉素（mTOR）的抑制剂，作为自噬诱导剂被广泛研究，并促进宿主消除MTB。虽然已经确定了几种作为HDT候选的自噬诱导剂，但只有少数几种进入了结核病的临床试验。因此，需要更多潜在的HDT候选药物来确定更有效和安全的抗结核药物。

Trog是一种噻唑烷二酮和过氧化物酶体增殖物激活受体-γ (PPARγ)的配体。它是一种用于2型糖尿病的合成降糖药物，通过与PPARγ激活密切相关的机制增强组织对胰岛素的敏感性，降低血糖水平。最近的研究表明，Trog通过一种依赖于PPARγ激活的机制诱导许多肿瘤细胞自噬。此外，其他糖尿病药物，如二甲双胍，通过诱导自噬来抑制MTB的生长；然而，Trog是否在巨噬细胞中诱导自噬并随后促进MTB清除在很大程度上仍然未知。在本研究中，我们研究了Trog作为HDT候选药物和与一线抗结核药物联合使用的有用辅助药物的潜力。

一、Trog降低巨噬细胞胞内MTB存活

通过CFU计数来确定抗糖尿病药物Trog、罗格列酮（Rosi）、吡格列酮（Piog）是否能抑制巨噬细胞内MTB的存活。从图1A可以看出，Trog（50µM）处理24-72 h后THP-1巨噬细胞中MTB的生长明显降低；然而，在Rosi和Piog治疗后，没有观察到差异（图1A）。Trog处理进一步增强THP-1巨噬细胞的杀分枝杆菌活性，并呈剂量依赖性（图1B）；然而，在Rosi或Piog处理后，没有观察到这种趋势。Trog处理的BMDM细胞也增加了分枝杆菌杀灭活性（图1C）。结果表明，Trog可降低巨噬细胞内MTB的存活。为了确定Trog的抑菌作用是否来自于对MTB的直接抑制，我们在体外以指定的浓度加入Trog进行抑菌试验（图1D）。50µM浓度的Trog对MTB的生长没有抑制作用；然而，在浓度为150µM时，观察到对MTB有轻微的抑制作用，也引起了明显的细胞毒性（图1D）。综上所述，Trog可能以巨噬细胞为靶点，调节巨噬细胞的功能，从而发挥抗菌作用。

二、Trog通过促进自噬来降低巨噬细胞内MTB的存活

自噬在宿主巨噬细胞消除MTB中起重要作用；然而，MTB可能颠覆这一过程。多项研究表明，Trog促进肿瘤细胞的自噬。我们假设Trog介导的巨噬细胞自噬激活降低了MTB细胞内存活。正如预期的那样，与未处理的对照组相比，Trog刺激显著改善了MTB感染和未感染THP-1的巨噬细胞内的自噬，因为从LC3B-Ⅰ和p62转化的脂质结合LC3B-Ⅱ增加（图2A）。Trog处理没有诱导细胞凋亡，因为观察到类似水平的裂解caspase-3和annexin-Ⅴ阳性细胞。经Trog处理后，焦亡标志物，包括裂解的caspase-1和裂解的GSDMD （n端GSDMD，N-GSDMD）均无差异。虽然经Trog治疗后IL-1β分泌水平下降，与既往研究相似，但这可能是Trog抗炎作用的结果。此外，Trog治疗没有影响铁死亡，因为观察到GPX4或脂质过氧化（丙二醛）水平没有差异。这些结果表明，Trog诱导的自噬，而不是细胞死亡途径，促进了巨噬细胞内MTB的清除。

NH4Cl是一种溶酶体抑制剂，通过降低LC3B-Ⅱ和p62的降解来抑制自噬通量的激活。在NH4Cl存在下，trog诱导的LC3B-Ⅱ和p62水平进一步增强，这表明发生了自噬通量激活。透射电镜结果一致显示，Trog预处理和MTB感染的巨噬细胞中自噬液泡增加。雷帕霉素（Rapa）处理的巨噬细胞作为阳性对照。为了进一步证实Trog诱导的自噬激活，利用mRFP-GFP-LC3报告细胞THP-1观察自噬小体和自噬小体中LC3的积累情况。共聚焦显微镜显示，与各自的对照相比，MTB感染和未感染的THP-1巨噬细胞与Trog预孵卵相比，自噬体和自溶体点状形成升高（图2B）。此外，细菌、p62和LAMP1之间的共定位增强也证明了Trog诱导了异种吞噬的增加（图2C）。Trog对LAP没有影响，因为细菌和p40phox的共定位没有显著差异。结果表明，Trog诱导的自噬通量增加抑制了细胞内MTB的存活。

ATG5在自噬的启动和处理以及宿主对MTB感染的防御中起重要作用。构建ATG5敲低巨噬细胞，进一步证明Trog在自噬激活和细胞内MTB清除中的作用。ATG5敲低使ATG5表达降低30%-45%（图2D）。此外，与对照组相比，Trog处理显著增强了siNC转染巨噬细胞的自噬；然而，在Trog处理的ATG5敲低巨噬细胞中，LC3B-Ⅱ降低这种差异几乎消失（图2D）。通过共聚焦显微镜观察到类似的结果，在Trog处理、MTB感染和未感染的ATG5敲低的巨噬细胞中，与各自的对照组相比，自噬体和自溶体点减少。同样，Trog治疗显著降低了siNC转染巨噬细胞的细胞内MTB存活率，而ATG5敲低巨噬细胞的效果显著降低（图2D）。我们进一步在Bafilomcin A1存在下进行CFU计数，Bafilomcin A1通过抑制溶酶体降解来阻止自噬，发现Trog介导的分枝杆菌杀灭作用几乎消失（图2D）。总的来说，我们的数据表明Trog通过促进自噬来降低巨噬细胞内MTB的存活。

三、Trog通过LKB1-AMPKα信号介导细胞自噬

Trog治疗可促进癌细胞AMPKα磷酸化（p-AMPKα）和自噬。因此，为了确定Trog介导的自噬的潜在机制，在Trog治疗后测量p-AMPKα水平。p-AMPKα在Trog处理的THP-1巨噬细胞中显著升高。在LC3B-Ⅱ水平中也观察到类似的趋势，而AMPKα水平没有显著差异。此外，Trog预孵育显著提高了MTB感染巨噬细胞中p-AMPKα和LC3B-Ⅱ水平，而AMPKα蛋白水平没有显著变化（图3A，B）。在Trog处理后，在MTB未感染和感染的BMDM细胞中也观察到类似的结果。AMPK可直接磷酸化mTORC1亚基Raptor （mTOR的调控相关蛋白），抑制mTORC1通路，进而抑制mTORC1对ULK1的抑制作用，而ULK1是自噬通路的重要正向组分。此外，AMPK可以直接磷酸化并激活ULK1，从而引发自噬。正如预期的那样，Trog处理提高了Raptor和ULK1的磷酸化水平（图3C，D）。p-AMPKα和LC3B-Ⅱ水平也出现了类似的趋势，而Raptor、ULK1和AMPKα水平相对不变（图3C，D）。结果表明，mTORC1途径被抑制，而AMPK活性和自噬被诱导。虽然我们观察到在Piog而不是Rosi处理后p-AMPKα升高，但与Trog处理相比，Piog诱导的p-AMPKα水平远低于Trog处理。此外，我们只观察到Piog治疗后LC3B-Ⅱ水平略有增加，而Rosi治疗后则没有。这些结果可能解释了Piog和Rosi在巨噬细胞中杀灭分枝杆菌的作用很小。结果表明，Trog诱导的p-AMPKα参与了巨噬细胞的自噬激活。

人类肿瘤抑制因子LKB1是一种主丝氨酸-苏氨酸激酶，可直接磷酸化并激活AMPKα。为了确定Trog诱导的AMPKα磷酸化激活是否与LKB1相关，构建LKB1敲除THP-1的巨噬细胞，然后进行Trog处理。LKB1特异性siRNA显著降低巨噬细胞中LKB1的表达（图4A）。此外，不经Trog处理，p-AMPKα和LC3B-Ⅱ在LKB1敲除的巨噬细胞中显著降低。Trog刺激的p-AMPKα和LC3B-Ⅱ在siNC转染的巨噬细胞中显著增强，而在LKB1敲低的巨噬细胞中作用减弱（图4A）。共聚焦显微镜实验也得出了类似的结论。此外，在MTB感染的LKB1敲除的巨噬细胞中，Trog诱导的自噬体和自溶酶体点的形成减少（图4B，C）。同样，在LKB1敲低的巨噬细胞中，Trog介导的细胞内MTB存活的抑制被显著消除（图4D）。这些结果表明，Trog介导的自噬和细胞内MTB存活的抑制与LKB1-AMPKα信号传导有关。

四、INH与Trog联合可促进MTB的清除

我们评估了Trog和INH在体内抗结核活性的叠加作用。对感染MTB的小鼠分别给予INH/Trog或INH和Trog联合灌胃。在体外实验中也观察到类似的结果（图5A， B）。无论是MTB H37Rv-还是异烟肼耐药株C2感染小鼠，与溶剂处理组相比，Trog处理组的病理性肺损伤都得到了改善（图5C）。INH处理组对MTB H37Rv感染小鼠的病理性肺损伤有显著改善，Trog + INH处理组进一步增强（图5C）。然而，在溶剂处理组中，INH处理和C2感染的小鼠表现出严重的病理性肺损伤，而在Trog + INH处理组中，这种情况有所改善（图5C）。此外，在WT H37Rv感染组和C2感染组中，Trog处理组CD86+巨噬细胞LC3B的平均荧光强度（MFI）均高于INH处理组和溶剂处理组（图5D），在Trog + INH处理组中也出现了这种趋势（图5D）。这些结果表明，Trog触发的自噬在体内的细菌杀灭活性中起主要作用。综上所述，我们的数据表明Trog是一种潜在的HDT候选药物，可单独用于抗结核治疗或与抗结核药物联合使用。