ATAXIN-2中等长度的PolyQ扩增引起ALS 相关代谢和免疫表型
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2024-12-27 08:03
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肌萎缩性侧索硬化（Amyotrophic lateral sclerosis, ALS）是一种成人发病的神经退行性疾病，以上、下运动神经元进行性变性丢失为主要特征。现有研究证据表明，ATAXIN-2（ATXN2）基因中等长度的CAG重复扩增显著增加ALS发病风险，并促进TDP43病理改变。有趣的是，对TDP43小鼠模型敲除ATXN2或使用ASO方法降低ATXN2表达水平，可以明显延长小鼠生存时间 ，延缓疾病进展，支持ATXN2是ALS的治疗靶点。然而，ATXN2的CAG重复如何在细胞和功能水平上触发 ALS 的具体分子机制尚不清楚。为明确ATXN2中等长度扩增的下游致病机制，近期发表在Nature Communication杂志的一项研究使用患者源性诱导多能干细胞（iPSC）衍生的运动神经元和携带ATXN2中等长度扩增的小鼠模型作为研究工具，揭示了ATXN2中等长度扩增导致的ALS相关表型及机制，为靶向ATXN2治疗ALS提供了新见解。这项研究中使用的小鼠模型包括TDP-43M337V BAC转基因小鼠和ATXN2 BAC转基因小鼠，并将常规C57BL/6J小鼠作为对照，从小鼠胚胎中提取脊髓，并分离脊髓运动神经元进行培养。将健康对照和携带ATXN2中等长度扩增的ALS患者来源的iPSCs诱导分化为人类脊髓运动神经元（iPSC-derived spinal motor neurons, hMN）和大脑类器官。通过MACS分离小鼠脊髓和类脑器官中的小胶质细胞；使用脂多糖（LPS）处理类脑器官和小鼠，随后进行RNA提取和定量RT-PCR分析；对小鼠行为进行周期性测试，包括握力和加速转轮实验；通过WB和RNA-seq分析蛋白质表达和基因表达差异；使用电生理学和扫描电子显微镜（SEM）分析细胞功能；采用单细胞RNA-seq和基因组学方法分析转录组数据，探讨小鼠和类脑器官中小胶质细胞改变。统计分析通过GraphPad Prism、R软件和相关生物信息学工具进行，确保数据的准确性和可重复性。1. ATXN2-ALS hMNs在体外显示出运动神经元病的早期迹象。超微结构分析显示，与健康对照iPSCs分化的hMNs相比，携带ATXN2中等长度扩张ALS患者iPSCs来源的hMNs（ATXN2-ALS hMNs）神经突起损伤显著增加（图1E，F）。进一步研究发现ATXN2-ALS hMNs细胞中应激颗粒的组装和动态过程出现明显缺陷（图1G-J）。全细胞膜片钳技术检测分析提示，ATXN2-ALS hMNs的电生理特性在不同的培养时间点出现异常变化：表现为在培养第12天表现为低兴奋性，而在第24天表现为高兴奋性（图1L，M）。![]()
图1. ATXN2-ALS hMNs在体外显示出运动神经元病的早期迹象。(A,B)对人类iPSC衍生的hMN培养物进行TUJ1、CHAT和ISL1免疫细胞化学染色；(C)对CTL hMNs在DIV12时进行电流钳制记录，记录电流注入后的反应；(D)基于RaceID2对hMN培养物的单细胞RNA测序实验的t-SNE图;（E）DIV12时对CTL和ATXN2-ALS hMN培养物进行的扫描电镜图像；(F)对E中损伤的神经突起进行定量分析;（G）在DIV9 hMNs中进行PABP免疫细胞化学染色，经过60分钟的三氧化二砷（ARS）处理后;（H）对每个神经元的应激颗粒（SGs）数量进行定量分析;（I）对SG面积进行定量分析；（J）在DIV9 hMNs中，ARS处理后60分钟和恢复120分钟时SG面积的分布；（K）在DIV12 hMN培养物中进行ATXN2免疫细胞化学染色；（L,M）对2个CTL和2个ATXN2-ALS系的hMN培养物进行电流钳制记录。2.为了研究ATXN2-ALS hMN中受影响的分子通路及其可能导致观察到的细胞表型，研究者在DIV12时对hMN培养物进行RNA测序，以识别可能驱动运动神经元功能障碍的因素。分析结果揭示了25个在ATXN2-ALS与CTL hMNs之间差异表达的基因（DEGs）（图2A），其中一些基因已知与脂质代谢（如PLP1）和线粒体功能（如NNMT1、GPD1）相关（图2B）。进一步使用Seahorse分析评估hMN培养物的生物能状态，发现ATXN2-ALS hMN培养物的基础呼吸、最大呼吸能力和ATP生成显著降低（图2C–F），ATXN2-ALS hMN培养物的糖酵解和糖酵解能力也有所下降（图2G–I）。总的来说，以上实验表明，来自ATXN2-ALS患者的hMN在基因表达、神经元完整性、应激颗粒动力学、兴奋性、细胞代谢和线粒体功能方面存在特定的变化和缺陷。![]()
图2. ATXN2-Q33影响运动神经元线粒体相关基因的表达和功能。（A）在DIV12时对CTL和ATXN2-ALS iPSC衍生的hMN培养物中差异表达基因进行层次聚类；（B）差异表达基因的火山图；（C-I）在DIV12 hMN培养物中代表性的动力学图表。3.为分析ATXN2中间扩增在ALS中的体内效应，研究人员生成了携带人类ATXN2基因的小鼠模型，分别携带Q22和Q33重复扩增，并进一步与ATXN2小鼠与携带人TDP-43M337V变异的转基因小鼠进行交配，获得同时携带ATXN2重复扩增和TDP-43M337V变异的小鼠（ATXN2Q33/+;TDP-43Tg/+小鼠）。该小鼠具有ALS表型相关的运动缺陷（图3A，B）。此外，在ATXN2Q33/+;TDP-43Tg/+小鼠中还观察到神经肌肉接头的面积和周长显著减少（图3C–G），Purkinje细胞变性丢失（图3H，I）。![]()
图3. ATXN2-Q33在TDP-43突变小鼠背景下引起运动缺陷、神经肌肉接头变化和Purkinje细胞变性。（A，B）小鼠行为实验，（A）转棒实验，（B）握力；（C-G）神经肌肉接头定量检测分析；（H）小脑组织的免疫组化图像；（I）Purkinje细胞定量结果。4. ATXN2-Q33-TDP-43M337V相互作用触发小鼠体内转录改变。取10月龄大模型小鼠的脊髓组织进行RNA测序，ATXN2Q33/+;TDP-43Tg/+小鼠展示了显著的转录组变化，特别是在与线粒体功能和炎症反应相关的基因中（图4）。图4. ATXN2-Q33-TDP-43M337V相互作用导致转录改变。（A）使用DESeq2对10个月龄小鼠脊髓样本的原始计数进行对数转换后，基于所有基因的无监督层次聚类分析；（B-D）火山图展示差异结果；（E，F）基因集富集分析。5. ATXN2Q33/+;TDP-43Tg/+小鼠脊髓中小胶质细胞的基因表达和形态发生改变（图5）。在由患者来源的iPSC分化为的脑类器官中，小胶质细胞亦显示出类似的表达改变（图6）。![]()
图5. ATXN2Q33/+;TDP-43Tg/+小鼠脊髓中小胶质细胞基因表达和形态的变化。
图6. ATXN2-ALS中脑类器官中的小胶质细胞基因表达发生改变。本研究利用患者来源的iPSC及其分化的运动神经元和脑类器官，并结合小鼠模型，整合分子、细胞和表型数据，发现ATXN2-Q33重复扩增不仅导致运动功能缺损、神经肌肉接头变化和脊髓前角细胞退化，还影响了应激颗粒动态、线粒体功能和炎症反应，特别是小胶质细胞相关的反应。该研究揭示了ATXN2中间扩增在ALS中的致病机制，并为未来治疗策略开发提供了有价值的框架。![]()
Vieira de Sá R, Sudria-Lopez E, Cañizares Luna M, et al. ATAXIN-2 intermediate-length polyglutamine expansions elicit ALS-associated metabolic and immune phenotypes. Nat Commun. 2024 Aug 29;15(1):7484. doi: 10.1038/s41467-024-51676-0. PMID: 39209824.![]()
校 审：商慧芳
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