大肠杆菌中重组抗体的生产与表征

大肠杆菌自上世纪80年代以来成为重组蛋白生产的理想宿主，至今已有超过85种药物通过大肠杆菌生产。与其他宿主相比，大肠杆菌具备生长快速、成本低、操作简便、生产率高等优势。此外，大肠杆菌能够在细胞质、周质或培养基中表达重组蛋白，提供更大的生产灵活性（图2）。目前，已有七种获得批准的抗体片段或衍生物在大肠杆菌的不同区域中生产（表1）[2]。

1984年，研究人员发现在大肠杆菌还原性细胞质中表达全长免疫球蛋白（Full-length immunoglobulin G，FL-IgG）时，形成包涵体，随后通过溶解和复性进行处理，但仅观察到极少的抗原结合活性，随后，研究重心从还原性细胞质转向氧化性周质空间。2002年，Simmons等首次报道在周质中表达功能性FL-IgG（图3a）。通过优化周质中重链和轻链的表达与分泌平衡，并使用特定启动子和信号序列，成功在10 L发酵罐表达了几种FL-IgG。随后，Reilly和Yansura通过过表达氧化和异构化伴侣蛋白DsbA和DsbC，使IgG1在高密度发酵中实现高产量。此外，Genentech公司利用Knobs-into-Holes（KiH）技术，在大肠杆菌周质中开发了双特异性抗体表达系统（图3b），成功生产多种抗体，包括靶向IL-4和IL-13的IgG4双特异性抗体（Bispecific antibodys，BsAbs），应用于哮喘治疗。该公司还通过共培养方法生产了27种不同的BsAbs，并报告了成功生产抗CD3 BsAbs。

尽管大肠杆菌周质空间已被广泛应用生产FL-IgG，但由于其体积较小和转运瓶颈，大肠杆菌细胞质成为FL-IgG生产的另一个选择。1984年，Genentech和Celltech分别在大肠杆菌细胞质中首次报道了FL-IgG和FL-IgM抗体的表达。但是由于细胞质环境过于还原，抗体通常积累在包涵体中，需通过复性处理恢复抗原结合活性。

细胞质中过于还原的环境阻碍了二硫键的正确配对，影响了FL-IgG的功能表达。为克服这一问题，研究人员通过改造大肠杆菌菌株，创造了一个更具氧化性的细胞质环境，成功表达了包括FL-IgG在内的二硫键蛋白。

大肠杆菌细胞质中存在两条还原途径——硫氧还原蛋白和谷胱甘肽还原蛋白途径，它们会还原二硫键，通过删除相应还原酶基因gor和trxB来去除这两条还原途径，并通过突变过氧化物酶基因ahpC，研究者开发出能够支持二硫键形成的SHuffle^®菌株。该菌株可以在细胞质中成功生产多种可溶性且功能性强的FL-IgGs。2015年，Robinson等人首次报告了在SHuffle^®菌株中成功生产具有正确二硫键结构的抗HER2和抗VEGF抗体。

除传统的细胞表达系统外，FL-IgG也可以在无细胞蛋白表达系统（Cell-free protein synthesis，CFPS）中生产。2008年，首次有报道展示了在大肠杆菌无细胞系统中生产活性抗体。Sutro Biopharma进一步优化了CFPS方法，通过调整重链和轻链基因的翻译起始区，并添加伴侣蛋白DsbC和FkpA，成功实现了1 g/L的IgG产量。此外，该公司还通过CFPS成功生产了带有KiH突变的BsAbs，并将DsbC和FkpA基因整合到其CFPS提取物来源菌株的染色体中，开发了一种基于连续发酵的细胞提取物制备方法，用于生产抗体药物偶联物（Antibody-Drug Conjugates，ADCs）

生化表征是抗体质量控制的基础，通过高效液相色谱、质谱分析、SDS-PAGE电泳等方法分析抗体的分子结构、氨基酸序列、糖基化修饰和分子量等，并测定抗体的抗原结合能力、亲和力和特异性。

首个经过生化特征彻底表征的大肠杆菌生产的FL-IgG是由Genentech在大肠杆菌的周质中生产的抗TF抗体，表征表明其抗原结合活性与哺乳动物细胞生产的同类抗体在抗原结合活性上相同。2008年，首次报道了大肠杆菌CFPS系统生产的抗肌酸激酶抗体的表征，与在哺乳动物细胞系中生产的同类抗体在亲和力上几乎没有差异。

总之，许多mAbs、BsAbs和ADCs已经成功地从大肠杆菌细胞质或周质，或从体外无细胞系统（如CFPS和PURE系统）中生产、纯化并表征，表明大肠杆菌表达系统在表征上取得了重要进展[3]。

生物物理表征包括评估其均一性、溶解性和聚集倾向。抗体的稳定性可通过对温度、储存条件、pH值、盐浓度等因素的评估来测试。通常大肠杆菌生产的去糖基化抗体认为具有稳定性较差的特性，但研究表明其稳定性与糖基化抗体相似。2002年Genentech公司报告，在大肠杆菌周质中生产的抗TF抗体与CHO细胞生产的抗体具有相似的四级结构和稳定性。2008年，CFPS系统生产的抗MAK33抗体与CHO细胞生产的同类抗体展现出相似的热稳定性。尽管生物物理表征研究有所局限，但已显示大肠杆菌生产的去糖基化抗体在所测试的条件下展现出与哺乳动物细胞生产的糖基化抗体相似的稳定性特征。

生物学表征用于评估抗体的生物活性，包括细胞培养实验、流式细胞术、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（Antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC）、补体依赖性细胞溶解（Complement dependent cytotoxicity，CDC）等,这些方法可以验证抗体的免疫学效应，确认其是否能够有效结合靶标，并诱导免疫反应。IgG类药物的治疗效果来源于两种机制：首先，通过Fab区域与靶抗原结合；其次，通过Fc域介导免疫反应，发起抗病原体或癌细胞的免疫反应。分析结果表明去糖基化抗体在这些机制上与糖基化抗体相似。

早期的研究表明，由于大肠杆菌产物缺乏糖基化修饰，所生产的抗体分子无法与FcɣRI、FcɣRIIIa和C1q结合，因此缺乏ADCC、CDC活性。随后，经进一步研究显示，大肠杆菌生产的无糖基化曲妥珠单抗（trastuzumab）与FcɣR1结合的亲和力降低，导致ADCC、CDC功能完全丧失。尽管如此，这些无糖基化抗体仍能在其他方面保持治疗效能。

研究表明，缺乏N-糖基化的IgG能够维持较长的血清半衰期，这主要归因于其与FcRn受体的pH依赖性结合。因此，大肠杆菌生产的无糖基化IgG可能在缺乏Fc效应功能的情况下，仍能维持较长的血清半衰期。

例如，比较大肠杆菌来源的抗TF IgG1抗体与CHO细胞来源的IgG2和IgG4抗体在黑猩猩中的药代动力学，结果显示它们的半衰期相似。此外，大肠杆菌生产的无糖基化抗体与CHO细胞生产的糖基化抗体在猕猴中的药代动力学特性也相似。Genentech公司还研究了至少六种通过其KiH技术在大肠杆菌中生产的BsAbs的药代动力学特性。研究发现，在所测试的动物模型中，大肠杆菌生产的无糖基化抗体的药代动力学特性与其哺乳动物细胞生产的糖基化同类抗体相似。

大肠杆菌生产的去糖基化抗体因缺少N糖链，无法有效结合FcɣRs或C1q，从而丧失ADCC和CDC等免疫效应。通过工程化改造Fc结构域，可以恢复或增强这些功能（表2）。例如，Jung等人通过展示Fc突变体文库，筛选出能够选择性结合FcɣRI并诱导HER2过表达肿瘤细胞强烈ADCC的突变体（Fc5）。其他研究也通过优化Fc结构域，提高了与不同FcɣRs和C1q的结合选择性，从而增强了ADCC效应功能[4]。

此外，设计去糖基化抗体与FcɣRIIIa结合，可以显著增强免疫效应，尤其是在与巨噬细胞结合时，能够触发强烈的抗体依赖性细胞吞噬活性。这些工程化抗体不仅在体外表现出显著生物效应，还在体内展现了良好的免疫活性和治疗潜力。总体来说，Fc工程化为恢复去糖基化抗体的免疫效应提供了有效方案，提升了其在肿瘤免疫治疗中的应用前景。

在过去十年中，mAbs的生产在大肠杆菌的细胞质和周质区室及无细胞系统中取得了重要进展，显著提高了抗体的滴度和质量，降低了制造成本。这些进展使得大肠杆菌生产的无糖基化抗体在过敏、免疫学和肿瘤学等领域的临床应用具有更大潜力。虽然无糖基化抗体缺乏ADCC、CDC等Fc介导的效应功能，但通过工程设计，一些无糖基化抗体展现出增强的效应功能，甚至发现了新的效应子功能。总而言之，大肠杆菌生产的无糖基化抗体具有与哺乳动物细胞生产的糖基化抗体相当的治疗潜力。预计未来将有更多基于大肠杆菌生产的无糖基化抗体分子进入临床研究。