以全灭活病毒为基础的狂犬病毒（RABV）疫苗在人类与狂犬病40年的抗争过程中已挽救了无数生命。尽管已经有非常有效的人类狂犬病疫苗和免疫球蛋白联合进行暴露后预防措施，但对需求量大的地区来说，并不一定可得和可及。目前，唯一获得批准的狂犬病疫苗类型是灭活疫苗，免疫原性有限。世界卫生组织建议采用3剂免疫接种进行接触前预防，暴露后预防接种4至5剂。复杂的免疫接种方案给低收入和偏远地区的高风险人群带来了巨大负担。
最近，包括CureVac、艾美疫苗在内的多家企业和科研机构，已经开发了新型mRNA狂犬病疫苗。CureVac在Nature Communications上发表了mRNA狂犬疫苗在恒河猴模型中的保护效力研究，并与上市灭活疫苗Rabipur瑞必补尔进行了头对头对比试验[1]。对比灭活疫苗Rabipur，mRNA疫苗编码RABV-G可以诱导更高水平的交叉中和抗体，产生更广泛的反应性抗体保护。不久前，艾美疫苗/丽凡达生物联合病毒病预防控制所发表了其自主研发的mRNA狂犬病候选疫苗LVRNA001在不同动物模型中的保护效力和安全性评估。研究表明，在食蟹猴、犬、大鼠体内反复施用LVRNA001不会引起全身毒性，同时可有效产生针对狂犬病病毒的强烈特异性免疫反应[2]。
2024年12月31日，中国药科大学唐昕莹、杨勇团队联合中国农业科学院长春兽医研究所闫飞虎、中国科学院杭州医学研究所张亮，在期刊Molecular Therapy上发表了题为“A nucleoside-modified rabies mRNA vaccine induces long-lasting and comprehensive immune responses in mice and non-human primates”的研究论文[3]。本研究设计开发的mRNA-LNP狂犬病疫苗在恒河猴和小鼠中与灭活疫苗进行了头对头比较。研究表明，mRNA疫苗能够以较低剂量即在恒河猴体内诱导高水平的病毒中和抗体（VNA）、持续的体液和细胞反应以及免疫记忆，并具有良好的安全性，在小鼠中可对致命的狂犬病毒攻击提供完全的保护。
抗原与疫苗设计
狂犬病病毒糖蛋白（RABV-G）是狂犬病的主要免疫原，已被广泛用于疫苗开发。本研究选择CTN-1株（Genbank：FJ959397.1）的G蛋白序列作为抗原，该序列与中国街头狂犬病毒株有系统演化关系。利用LinearDesign算法，研究团队设计了两个优化后的序列CTN-1-G-A/B，与野生型序列（CTN-1-G-WT）相比，它们具有更高的密码子适应指数（CAI）和更低的最小自由能（MFE）。通过与尿苷（U）或N1-甲基假尿苷UTP（m1ψ）结合，进行体外转录（IVT）合成优化后的mRNA（图1B）。
所有候选序列在转染HEK293T细胞后均产生了稳定的蛋白表达。密码子优化和m1ψ修饰进一步提高了表达效率，延长了G蛋白的半衰期（图1C）。通过将CTN-1-G-mRNA包封到LNP递送系统中，制备了候选mRNA疫苗制剂。动态光散射（DLS）分析表明，LNP-mRNA的粒径为120-130nm（图1D）。
图1. 狂犬病mRNA疫苗的构建和表征
小鼠体内免疫原性评估
体液免疫反应
研究人员在BALB/c小鼠中进行了mRNA疫苗的免疫原性评估，并与商业灭活疫苗进行了比较。在第0天和第21天使用逐步增加剂量的mRNA疫苗（0.5、1.5或5 μg）或灭活疫苗（0.25 IU）免疫小鼠，并随后测定抗体反应（图2A）。
研究显示，候选mRNA疫苗可以产生剂量依赖性的体液免疫反应，具体而言，CTN-1-G-A和CTN-1-G-B在诱导抗体反应方面的能力总体上具有可比性，明显强于灭活组，CTN-1-G-A组的平均抗体滴度略高于CTN-1-G-B（图2B-D）。
接下来，研究人员进一步测定了VNA滴度。接受5 μg剂量CTN-1-G-A-m1ψ mRNA的小鼠在初免和增强免疫后产生最高的VNA滴度，显著高于灭活组（图2E）。第14天和第28天的VNA平均滴度分别为40.5 IU/mL和445.6 IU/mL，灭活组的VNA平均滴度分别为16.5 IU/mL和91.65 IU/mL。0.5 μg CTN-1-G-A mRNA诱导的VNA滴度最低，但仍与灭活组相当（图2E）。
图2. 狂犬病mRNA疫苗在小鼠体内诱导强大的体液免疫反应
所有疫苗组小鼠在初免14天内VNA滴度高于0.5 IU/mL，免疫后小鼠体重无显著差异（图2E-G）。此外，IgG同型表征发现，mRNA疫苗能在BALB/c小鼠中诱导特异性IgG1、IgG2（主要是IgG2a）和IgG3抗体，且呈剂量依赖性（图2H-K）。
考虑到mRNA疫苗在初免后诱导的VNA超过了保护阈值，研究人员采用了单一剂次的免疫接种程序，并进行狂犬病毒致死攻击试验。如图2L所示，1.5 μg的CTN-1-G-A-m1ψ对狂犬病毒具有完全的保护作用，而灭活疫苗组的1只小鼠在攻毒后10天死亡。攻毒后小鼠的体重无显著差异（图2M）。
综上所述，狂犬病mRNA疫苗可在小鼠体内诱导强大的体液反应，单次给予1.5 μg CTN-1-G-A-m1ψ mRNA可提供完全的保护作用。
细胞免疫反应
T细胞活化诱导标记物（AIM）检测显示，在CTN-1-G-A mRNA抗原刺激下，接种小鼠脾细胞中G蛋白特异性AIM+CD4+T细胞（图3A,B）和AIM+CD8+T细胞（图3C）得到显著的诱导。
酶联免疫斑点（ELISpot）检测发现，与灭活疫苗相比，CTN-1-G-A mRNA免疫可以诱导IFN-γ分泌型T细胞，呈现Th1型偏倚反应（图3D-F）。
细胞因子染色（ICS）实验显示，与灭活疫苗相比，CTN-1-G-A-m1ψ组小鼠的CD4+（图3G）和IFN-γ分泌型CD8+T细胞（图3J）的频率更高。TNF（图3H-K）和IL-2（图3I-L）分泌T细胞水平没有观察到显著差异。
这些结果表明，CTN-1-G-A mRNA较灭活疫苗能更有效地诱导Th1偏倚型G蛋白特异性T细胞应答。
图3. 狂犬病mRNA疫苗较灭活疫苗能诱导更强的细胞免疫应答
长期体液免疫保护
研究人员在第98天和第126天再次测量了特异性IgG滴度（图4A,B），在接受0.5 μg、1.5 μg和5 μg剂量的CTN-1-G-A-m1ψ mRNA的小鼠中，VNA滴度分别下降到116.9 IU/mL、70.2 IU/mL和70.2 IU/mL，而灭活组的平均VNA滴度下降到28.6 IU/mL（图4C）。
在免疫6个月后通过分析CD19+B220+FAS-IgD-CD38+CTN-1-G+细胞来检测记忆B细胞（MBCs）的丰度（图4D,E）。CTN-1-G-A mRNA免疫小鼠中MBCs明显增加，而灭活疫苗组中MBCs的比例几乎检测不到。
流式细胞术结果显示，mRNA疫苗诱导的抗原特异性GC B细胞水平显著高于灭活疫苗，而总GC B细胞的频率没有显著差异（图4F-I）。
综上所述，这些数据表明，CTN-1-G-A mRNA诱导了小鼠持久的体液免疫反应。
图4. 狂犬病mRNA疫苗在小鼠中诱导高水平的持续体液免疫
恒河猴体内免疫评估
非人灵长类动物（NHP）是临床前疫苗评估的理想动物模型，研究人员评估了CTN-1-G-A-m1ψ mRNA（30 μg）和灭活疫苗（2.5 IU）在恒河猴体内诱导的特异性抗体和B细胞反应、T细胞反应和炎症因子释放（图5A）。在NHP中，CTN-1-G-A-m1ψ mRNA诱导了更高的IgG和VNA滴度（图5B,C）。
初免14天后，mRNA组的VNA滴度为42.9 IU/mL，高于灭活组的23.4 IU/mL，远高于保护阈值（>0.5 IU/mL）。VNA滴度在增强免疫接种1周后达到峰值，随后逐渐下降。值得注意的是，免疫后27周，mRNA组和灭活组的VNA滴度分别为94.5 IU/mL和6.5 IU/mL，与峰值滴度相比分别降低了4.08倍和17.99倍，降低速度也显著更缓（图5C）。免疫19周后，mRNA组中特异性转换的IgG+MBC频率也更高（图5D,E）。
ICS分析显示与小鼠模型中一致的结果，mRNA疫苗较灭活疫苗诱导了更高频率的IFN-γ分泌型T细胞（图5F-H）。这些结果表明，CTN-1-G-A-m1ψ具有更优越的长期保护效率。
量化恒河猴体内的炎症细胞因子，检测到的大部分细胞因子在接种后1天出现短暂的增加，并在1-2周内恢复到正常水平，表明mRNA疫苗刺激的细胞因子分泌是可控的（图5I）。值得注意的是，观察到mRNA组在免疫后IL-6显著增加，为驱动免疫GC形成的关键细胞因子。
这些结果证明了CTN-1-G-Am1ψ可以在恒河猴中诱导比灭活疫苗更有效的免疫应答，其特征是持久的VNAs高滴度、更多的MBCs和强大的Th1型T细胞应答。
图5. 狂犬病mRNA疫苗在恒河猴体内诱导了强大的免疫应答
安全性评估
由于狂犬病毒感染的高度致死性和可防不可治的特性，决定了需要把狂犬病疫苗的安全性评估放在首要地位。
研究人员首先监测了接种前后血清生化参数的变化（图6A），结果表明，恒河猴对核苷修饰的狂犬病mRNA疫苗耐受性良好，无肝肾毒性，血液中的生化参数波动在一周内恢复到基线水平。值得注意的是，在初始免疫和增强免疫后，mRNA组的肌酸激酶（CK）水平都较低，表明心脏毒性较低。
接下来，研究人员评估了血液学参数（图6B）。免疫接种后，白细胞计数、血小板计数和嗜酸性粒细胞百分比均出现了短暂的增加，并在7天内恢复正常。
总的来说，这些数据表明CTN-1-G-A-m1ψ mRNA疫苗在非人类灵长类动物中具有良好的安全性。
图6. 狂犬病mRNA疫苗在恒河猴中显示出高度安全性
总结
本研究数据表明，狂犬病mRNA疫苗在小鼠和恒河猴中都优于已批准的灭活疫苗，凸显了mRNA平台在开发下一代狂犬病疫苗方面的潜力。研究证明了mRNA狂犬病疫苗可以在小鼠和恒河猴中诱导较灭活疫苗更多的抗原特异性GC B细胞，以及更高的特异性IFN-γ+T细胞免疫应答。与此同时，研究发现在免疫后恒河猴模型中IL-6的短暂增加，进一步促进免疫GC形成，有助于狂犬病mRNA疫苗接种提供的持续体液反应和长期保护。
参考资料
