仁济核医学科研成果速递：EpCAM特异性免疫PET显像

上皮细胞粘附分子（EpCAM，CD326）分子量大小为40 kDa，是一种跨膜糖蛋白，通常在几乎所有上皮细胞表面表达，与其他细胞粘附分子一起参与维持上皮细胞的稳定性。EpCAM表达水平在大多数上皮源性肿瘤细胞表面显著上调，包括结直肠癌、乳腺癌、胃癌、前列腺癌、卵巢癌和肺癌等。此外，正常淋巴结中EpCAM几乎没有表达，而在上皮源性肿瘤的转移性淋巴结中通常高表达EpCAM。因此，EpCAM 是一种潜在的肿瘤诊疗靶点。EpCAM靶向治疗近年来已从基础研究走向临床应用转化，为癌症患者提供了新的潜在治疗选择。EpCAM 特异性全人源单克隆抗体（mAb）Adecatumumab在表达 EpCAM 的转移性乳腺癌患者中显示出剂量和靶点依赖性的抗肿瘤活性。卡妥索单抗是一种靶向EpCAM的T细胞衔接双特异性抗体药物，于2009年获得欧洲药品管理局（EMA）批准用于治疗EpCAM阳性恶性肿瘤所致恶性腹水，显示出良好的安全性及临床疗效。但如何无创精准可视化EpCAM异质性表达，筛选EpCAM表达阳性患者，进一步给予恰当的靶向或免疫治疗方案，是有待解决的临床挑战。

免疫PET显像（immunoPET）作为一种新型的分子影像方式，是肿瘤关键靶点可视化的最佳方式之一，并在优化肿瘤靶向治疗及免疫治疗中发挥重要作用（Chem Rev. 2020;120(8):3787-3851.）。仁济医院核医学团队长期致力于新型免疫PET显像探针的基础研发与临床转化应用；团队经深入调研认为：发展新型EpCAM特异性免疫PET显像新策略有望无创可视化实体瘤EpCAM的异质性表达，并优化EpCAM特异性肿瘤靶向或免疫治疗。

1. 第一代EpCAM特异性单域抗体制备及表征

通过用重组人EpCAM蛋白胞外结构域免疫羊驼、构建DNA文库、噬菌体筛选、二代测序及蛋白重组表达等分子生物学手段，团队首先成功获得三株EpCAM特异性单域抗体（即EPCD1、EPCD2和EPCD3），其中EPCD3纯度较为优异（SDS-PAGE分析纯度>95%、HPLC分析纯度 77.106%）。表面等离子共振法（SPR）亲和力测定结果表明：EPCD3与人EpCAM重组蛋白亲和力较高，K_D值为1.74 nm（图1）。

图1：第一代EpCAM特异性单域抗体制备及表征。（a−f）单域抗体EPCD1−3 SDS-PAGE和HPLC实验结果；（g−i）单域抗体EPCD1−3 SPR亲和力测定结果。

2.第一代EpCAM单域抗体探针在体免疫PET显像

基于EPCD1−3，团队进一步制备了第一代EpCAM特异性单域抗体探针[⁶⁸Ga]Ga-NOTA-EPCD1、[⁶⁸Ga]Ga-NOTA-EPCD2和[⁶⁸Ga]Ga-NOTA-EPCD3。在无荷瘤小鼠显像及定量分析结果表明，探针[⁶⁸Ga]Ga-NOTA-EPCD1在肝脏富集较高，而[⁶⁸Ga]Ga-NOTA-EPCD2和[⁶⁸Ga]Ga-NOTA-EPCD3药代动力学与体内分布特征相似，二者均通过肾脏快速排泄，体外生物分布实验结果进一步佐证了显像及感兴趣区定量分析结果（图2）。

图2：第一代EpCAM单域抗体免疫PET显像探针。（a−c）第一代EpCAM单域抗体免疫PET显像冠状位显像图。（d−f）[⁶⁸Ga]Ga-NOTA-EPCD1−3不同组织器官感兴趣区定量分析结果。（g）[⁶⁸Ga]Ga-NOTA-EPCD1−3不同组织器官体外生物分布数据分析结果。

3. [⁶⁸Ga]Ga-NOTA-EPCD3和[¹⁸F]AIF-RESCA-EPCD3实体瘤免疫PET显像

根据上述体外亲和力测定及体内药代动力学评估结果，团队进一步在人结直肠腺癌LS174T和人食管鳞癌OE19皮下瘤模型中，考察了不同核素标记EPCD3单域抗体探针（[⁶⁸Ga]Ga-NOTA-EPCD3和[¹⁸F]AIF-RESCA-EPCD3）的临床前诊断效能。免疫PET图像及感兴趣区分析结果表明：探针[⁶⁸Ga]Ga-NOTA-EPCD3（图3a，b）和[¹⁸F]AIF-RESCA-EPCD3（图3e）在肿瘤部分均有一定程度的摄取，而未结合部分迅速经泌尿系统排泄排出体外。值得注意的是，[⁶⁸Ga]Ga-NOTA-EPCD3在肝脏有较高的非特异性富集，提示其药代动力学仍有改进的空间。

图3：[⁶⁸Ga]Ga-NOTA-EPCD3和[¹⁸F]AIF-RESCA-EPCD3不同实体肿瘤免疫PET显像。（a，b）[⁶⁸Ga]Ga-NOTA-EPCD3临床前免疫PET显像及（c，d）感兴趣区定量分析结果。（e）[¹⁸F]AIF-RESCA-EPCD3临床前免疫PET显像及（f）感兴趣区定量分析结果。

4.第二代EpCAM特异性单域抗体制备及表征 

为进一步优化靶向EpCAM单域抗体探针诊断效能及体内药代动力学，仁济核医学团队进一步制备了第二代EpCAM特异性单域抗体EPCD4、EPCD5和EPCD6。通过SDS-PAGE及HPLC 分析可知EPCD4−6均有较为优异的纯度，SPR亲和力测定结果表明三种新型EpCAM特异性单域抗体的亲和力常数均达到了纳摩尔级别。

图4：第二代EpCAM特异性单域抗体制备及表征。（a−f）单域抗体EPCD4−6 SDS-PAGE和HPLC。（g−i）单域抗体EPCD4−6 SPR亲和力测定结果。

5.第二代EpCAM特异性单域抗体免疫PET显像

人食管鳞癌OE19皮下瘤模型显像结果表明：[¹⁸F]AIF-RESCA-EPCD4、[¹⁸F]AIF-RESCA-EPCD5在肿瘤部位未能看到明显摄取（图5a,b）；多时间点[¹⁸F]AIF-RESCA-EPCD6免疫PET显像发现该探针在肿瘤部位早期（注射探针后5分钟）即可观察到明显的肿瘤摄取，且肿瘤部分的摄取较为稳定，该探针在正常组织器官的非特异性富集较低（图5c，d）。EPCD6封闭实验证实探针[¹⁸F]AIF-RESCA-EPCD6有较高的特异性（图5e−g）。上述数据表明[¹⁸F]AIF-RESCA-EPCD6免疫PET显像探针具有优异的药代动力学特征及无创可视化EpCAM表达水平的潜能。

图5：[¹⁸F]AIF-RESCA-EPCD6在OE19荷瘤小鼠模型免疫PET显像。（a，b）[¹⁸F]AIF-RESCA-EPCD4/5临床前免疫PET显像。（c）[¹⁸F]AIF-RESCA-EPCD6临床前免疫PET显像及（d）感兴趣区定量分析结果。(e−g)[¹⁸F]AIF-RESCA-EPCD6实验组和共注射封闭组定量分析及显像结果。

6.主要组织器官体外生物分布及皮下瘤免疫组化分析

随后进行的14种主要组织器官的体外生物分布数据证实了[¹⁸F]AIFRESCA-EPCD6实验组的肿瘤部位摄取及体内分布情况，而EPCD6阻断组的肿瘤部位摄取显著减少（图6a）。组织病理学染色研究表明，EpCAM 在 OE19 肿瘤细胞中呈阳性表达,反映了该蛋白在体内条件下的稳定表达（图 6b，c）。

图6:体外分布及免疫组化染色结果。(a)实验组和封闭组的14种主要组织器官的体外生物分布数据。(b,c)OE19皮下瘤EpCAM免疫组化及HE染色结果。

通过创新筛选制备高亲和力、高特异性单域抗体，系统开展临床前实验研究，团队成功研发药代动力学和可视化效能俱佳的EpCAM特异性单域抗体探针[¹⁸F]AIF-RESCA-EPCD6。[¹⁸F]AIF-RESCA-EPCD6免疫PET显像有望无创可视化实体瘤EpCAM异质性表达，进一步优化EpCAM特异性肿瘤靶向及免疫治疗。

原文链接：https://link.springer.com/article/10.1007/s00259-024-06910-8

 徐东升,第一作者

上海交通大学医学院附属仁济医院核医学科在读硕士研究生，师从刘建军教授和魏伟军教授。主要研究方向为免疫PET分子影像探针的研发与临床转化应用，以第一作者在EJNMMI（IF = 8.6）发表高质量学术论文 1 篇，以主要参与人申请国家发明专利 1 项。

 张友,第一作者

吉林大学临床医学本科毕业，于上海交通大学医学院仁济医院攻读专业型硕士及学术型博士，师从刘建军教授及魏伟军教授，主要研究方向为分子影像探针制备与免疫PET显像，重点聚焦靶向CD47、PD-L1、Trop2等靶点特异性分子影像探针的研发与临床转化应用，研究成果以第一或共同第一作者发表于Journal for Immunotherapy of Cancer（IF = 10.3）、Research（IF = 8.5）、EMBO Molecular Medicine（IF = 9.0）、EJNMMI（IF = 8.6）等期刊，申请中国发明专利2项。

魏伟军，通讯作者

医学博士，上海交通大学医学院附属仁济医院核医学科主治医师、副研究员；中国医师协会核医学医师分会第五届青委会副主委。先后主持国家自然科学基金面上项目及青年项目各1项，以科研骨干身份参加实施国家重点研发计划2项，并受上海市公卫优秀学科带头人、上海市青年科技启明星及上海交通大学医学院“九龙医学优秀青年人才奖”等项目资助。长期致力于诊疗一体化抗体探针的基础研发与临床转化应用，先后针对多个实体瘤及血液系统肿瘤关键靶点，创制系列具有完全自主知识产权单克隆抗体及单域抗体探针，经临床转化应用初步优化了部分恶性肿瘤的临床诊疗。目前以第一发明人申请中国发明专利18项（含PCT专利2项；授权4项），以第一或通讯作者（含共同）在European Urology、EMBO Molecular Medicine、Journal for Immunotherapy of Cancer、Advanced Science、EJNMMI、JNM、Research等期刊发表论著20余篇，并在Chemical Reviews、JNM（3篇）、Trends in Cancer（2篇）、MED等期刊发表特邀述评，阐述免疫PET显像与抗体诊疗一体化的基本内涵、探针研发思路及临床转化应用价值。同时担任AJNMMI（IF = 2.0）执行编辑，EJNMMI、EJNMMI Reports、Mol Pharm等期刊编委会成员。

   刘建军，通讯作者

教授，主任医师，博士生导师，上海仁济医院核医学科科主任；上海市医学会核医学专科分会候任主任委员；《中华核医学与分子影像杂志》常务编委；中国医师协会核医学分会常务委员兼总干事。近五年主持国家重点研发计划子课题1项、国家自然科学基金面上项目2项、省部级课题3项。以第一作者或通讯作者发表高水平论文50余篇，例如J Nucl Med、Eur J Nucl Med Mol Imaging、Radiology、中华核医学与分子影像杂志等；指导研究生发表论文40余篇。以第三完成人分别获得华夏科技进步奖一等奖1项、上海市科技进步等省部级二等奖2项、三等奖1项。作为仁济医院PI申报获得上海市第三期影像医学与核医学重点学科建设和卫生部医学影像科国家临床重点专科。

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