欢迎大家来到生信日报！最近经常听到大家吐槽生信发文难，发高分文更是难上加难，有思路也不好进行，这不，小记者给大家带来了老朋友：孟德尔随机化，随着MR的发展，大家也变着花样的发文，今天这篇文章是用MR加上共定位分析，也是换个疾病套上就能用哦！来跟着小记者看看今天的文章吧！
今天分享的文章是根据孟德尔的独立分离定律以及共定位分析来研究肌萎缩性脊髓侧索硬化症可用药的靶点，本文的一些亮点在此展示：
1）在本研究中，获得了可药用基因组的 eQTL 数据，并结合 ALS GWAS 的结果进行了 MR 分析，以确定与 ALS 相关的潜在可药用基因。2）通过进一步的共定位分析，获得了遗传关联性较强的目标基因，3）随后通过一系列标准深入研究了与可药用基因相关的 ALS 重组药物，并确定了 R788 和 AMX。最后的最后4）研究者还结合 ALS 细胞模型，进一步研究了可药用基因的靶点及其靶向药物的药理作用。结论是AMX 和 R788 被证实具有通过抑制神经炎症来减轻 ALS 进展的治疗潜力。
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题目：TBK1--肌萎缩性脊髓侧索硬化症的优先药物再利用靶点：可药用基因组孟德尔随机化和体外药理验证的证据
杂志：BMC Med
影响因子：IF=9.3
发表时间：2024年3月
研究背景
肌萎缩性脊髓侧索硬化症（ALS）是一种致命的运动神经元疾病，其特征是脊髓和大脑神经细胞进行性变性，导致患者残疾，最终死于呼吸衰竭。肌萎缩侧索硬化症的发病率约为十万分之五，患者通常在发病后2至5年内死亡。由于对其发病机理缺乏了解，治疗方法一直面临严峻挑战。目前，利鲁唑、依达拉奉、AMX0035和托福森已被FDA批准用于治疗ALS，它们分别通过减少谷氨酸释放、抗氧化、缓解线粒体功能障碍以及下调超氧化物歧化酶1（SOD1）蛋白水平来治疗ALS。然而，大多数药物只能稍微延缓AL的进展几个月。因此，当务之急是开发更有效的化合物，以治疗这一毁灭性疾病。
数据来源
研究者从eQTLGen中获得了等位基因频率，该频率是利用所有队列中报告的等位基因数计算得出的。对于脑组织，从PsychENCODE中获得了全部显著的顺式-eQTLs，脑组织顺式-eQTL数据是通过1387人的基因型和基因表达数据进行的，其中包括679名健康对照者、497名精神分裂症患者、172名躁郁症患者、31名自闭症谱系障碍患者和8名情感障碍患者。GWA在29,612例ALS患者和122,656例对照中进行；研究者使用了在欧洲血统人群（27,205例病例，110,881例对照）中进行的汇总结果。
数据内容 | 数据来源 | 样本信息 |
血液和脑组织的顺式-eQTL数据 | eQTLGen和PsychENCODE | 顺式-eQTL数据包括31684份血液和外周血单核细胞样本 |
研究思路
为了确定与ALS相关的治疗靶点，利用可药用基因的顺式-eQTL和ALSGWAS数据集进行了孟德尔随机化（MR）分析和共定位分析，以确定与ALS有显著关联的注释可药用基因靶点。通过随后的再利用药物发现和纳入标准选择确定了几个与其可药用基因靶点相对应的候选药物，这些候选药物已通过基因验证。随后进行了药理实验，进一步评估了基因支持的再利用药物在各种细胞模型中治疗ALS的潜在疗效。
图1 遗传工具变体选择、孟德尔随机化、再利用药物发现的鉴定和药理分析的图解摘要
主要结果
基因仪器变体选择
将重要的顺式-EQTL与可药用基因符号列表重叠后，得到了2347个血源性可药用基因和1679个脑源性可药用基因（图1A）。根据工具变异的选择标准，在发现分析中，共有1125个血源性可药用基因的1601个SNPs和648个脑源性可药用基因的693个SNPs被作为IVs用于进一步的MR分析。
基因表达与ALS后果之间的M分析
以位于TSS100kb范围内且FDR<0.05的SNPs为显著性阈值，在血液和大脑中发现了个独特的潜在药物靶点（图1B）。研究者总结了潜在的可药用基因列表，并根据这些基因的MR绘制了图（图2）。通过在GTEx中分析因果基因对应的IV是否会影响其他基因的表达，没有观察到TBK1的IV对其他基因的影响。但是发现与TNFSF12相关的IV会影响多个基因的表达。此外，MR分析结果显示，含有2个以上SNPs的基因IV只存在于血液中，对这些基因进行了敏感性分析。
图2 潜在可药用基因的磁共振和共定位结果
共定位结果
研究者对从磁共振分析和ALSGWAS信号中获得的重要基因进行了共定位分析（图1B），然后找到了与GWAS变异共定位且支持度较高的基因列表。血液中的两个重要基因（TBK1和TNFSF12）和大脑中的两个重要基因（RESP18和GPX3）确定存在共定位（图2）。
发现再利用药物
为了进一步确定潜在的再利用机会，为ALS患者的试验提供信息，研究者搜索ChEMBL、DrugBankOnline和以前的出版物。结果获得了分别作用于三个AL相关基因靶点的五种药物，包括TBK1、TNFSF12和GPX3（表1）。由于安全性和有效性不确定，这两种生物制剂未能通过二级筛选。AMX是FDA批准的TBK1抑制剂，而R788是FDA批准的SYK抑制剂，与TBK1具有高亲和力。它们被认为符合伦理认可和有效性，因此通过了三级筛选（图1B）。
表1 ALS 的三个可药用基因靶点和五个已确定可用于药物再利用的现有药物
确定AMX和R788为有前景的TBK1靶向抑制剂
有研究表明，AMX与TBK1的铰链区结合，在介导TBK1和IKKε的酶活性方面发挥了关键作用。采用细胞热转移试验（CETSA）研究了这两种化学物质对TBK1热稳定性的影响。结果表明，与载体对照相比，AMX对NSC-34细胞裂解物中TBK1热稳定性的影响在37-60°C的温度范围内表现出中等程度的差异。这些结果表明TBK1与R788或R406之间有很高的相互作用亲和力，尽管在CETSA试验中TBK1在服用R788后没有明显的热稳定性变化。
R788和AMX可抑制MSA-2诱导的cGAS/STING激活
MSA-2是一种与STING结合的非核苷酸STING激动剂。它通过TBK1/IRF3轴以及IKKε/NF-ҡB轴刺激cGAS/STING通路（如图3A所示）。Western印迹显示R788显著抑制了磷酸化TBK1和IRF3的水平，表明AMX具有靶向TBK1和IKKε的双重特异性，从而导TBK1在Ser172处磷酸化的负反馈。
图3 R788 和 AMX 可抑制 MSA-2 诱导的 cGAS-STING 通路激活
R788和AMX可抑制ALS相关毒性蛋白介导的cGAS/STING信号转导
研究者在NSC-34细胞中使用对照质粒（GFP）以及野生型和突变型质粒进行了瞬时转染试验（图1D）。观察到质粒转染本身触发了TBK1磷酸化，这是由于细胞质中发生了cGAS/STING对质粒DNA的基础反应。此外还应用强力霉素诱导系统在NSC-34细胞中表达了TDP43和Q331K突变质粒。结果显示，在该系统中，p-TBK1和p-IRF3受到R788的显著抑制（图4B）。此外，RT-qPCR数据显示，R788和AMX抑制了在过度表达TDP-43WT/Q331K或SOD1WT/G93A的NSC-34细胞中测试的最下游cGAS/STING效应因子的表达（图4C-F，H）。研究结果表明，R788和AMX对某些ALS相关神经炎症亚型具有潜在的保护作用。
图4 R788和AMX抑制了TDP-43/SOD1诱导的cGAS/STING依赖性促炎信号传导
对渐冻症先药基因的全表型MR分析
由于大多数药物都是通过血液循环发挥作用的，因此评估了血液中的TBK1靶向药物是否会对其他适应症产生有益或有害的影响。对SAIGE中的783种非ALS疾病或性状进行了更广泛的MR筛选，结果显示，使用Wald比率法未发现显著关联（FDR<0.05），这表明这些药物是安全的或副作用很小。
文章小结
这篇文章通过磁共振分析提供了支持TBK1、TNFSF12、RESP18和GPX3作为ALS治疗药物基因的遗传证据。在针对上述基因的候选药物中，FDA批准的药物R788和AMX是有效的TBK1抑制剂。随后的药理学研究验证了R788和AMX通过抑制TBK磷酸化治疗特定ALS亚型的潜力。孟德尔加上简单的湿实验也能发到9.3的高分呢！本文不光用到了MR还用到了共定位分析，确定了几个与其可药用基因靶点相对应的候选药物，后用到了湿实验进一步验证，这个套路也可以很简单的复现，孟德尔随机化已经在生信领域越来越火爆了！看到这里的小伙伴你还不动手吗？有思路无法实施，那就找小记者来讨论一下吧！
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