JBC︱徐州医科大学张赭课题组揭示小鼠内尔毛细胞BK通道非钙依赖激活机制及BK通道在听觉感知中的关键作用

学术   2024-11-12 00:00   上海  

【神经科学前沿技术培训系列】详见文末


撰文︱沈中山

审阅︱张  赭

责编︱王思珍


BK通道是一种广泛表达的钾通道,在许多生理过程中扮演着重要角色,如调节血压、神经兴奋性和突触传递[1-3]BK通道由四个α亚基构成[4],每个α亚基可与β亚基(β1-β4)或γ亚基(γ1γ4)以1:1的比例共组装,形成一个具有不同生物物理特性的八聚体通道,且该通道的激活受到细胞质Ca2+和膜电位变化的调节。BK通道在耳蜗内毛细胞中也扮演着重要角色[5]然而,有研究发现小鼠内毛细胞(IHCs)中的BK激活显示出G-V曲线的显著负向移动[6]比与LRRC52亚基(γ2)在爪蟾卵母细胞中共表达时BK通道的G-V曲线的移位更负[7]但这种移位背后的机制尚未可知。


BK通道的变构体中,STREX外显子已被确定为BK通道机械敏感性的关键决定因素,并在内毛细胞中表达[8, 9];此外,外显子9的替代剪接体(e9alt)被认为可以改变BK通道的电压依赖性[10],但其是否有助于耳蜗中BK通道的激活移位仍然未知。另外,BK通道对听觉感知的贡献也仍然不清楚。一项使用Slo1-/-小鼠的研究表明,小鼠从8周龄开始出现进行性的高频听力损失[11];而另一项研究报告称,BK-/-β1/β4敲除小鼠的听觉脑干反应(ABR)阈值均正常,且BK-/-小鼠被发现对噪声引起的听力损失具有抵抗力[12]这些相互矛盾的结果激发了作者进一步探究小鼠耳蜗中BK通道的功能。


2024117日,徐州医科大学唐琼瑶、张赭教授团队在Journal of Biological Chemistry杂志发表题为“The mechanism of Ca2+ independent activation of BKCa channels in mouse inner hair cells and the crucial role of the BK channels in auditory perception”研究论文。徐州医科大学麻醉学院博士研究生沈中山为论文的第一作者,乔月华、唐琼瑶、张赭教授为本文通讯作者。在此项研究中,作者提出机械力、特定变构体与LRRC52共表达对电压依赖性移动的叠加效应可能解释了在缺乏细胞内Ca2+的情况下,BK通道在IHCs中的激活的特性。揭示了在IHCsBK通道非钙依赖的激活机制,并强调了BK通道在听觉感知中的关键作用。


为了研究小鼠IHCs中表达的BK通道是否具有机械敏感性,作者首先通过免疫荧光检测证实了IHCs中机械敏感外显子STREXexon22)的表达,随后克隆了STREX变构体,并命名为STREX-2。另外,通过RT-PCR证实了e9alt变构体在小鼠IHCs中表达。


1. 小鼠IHCs中的BK通道的外显子STREXe9alt变构体


作者接下来通过在非洲爪蟾卵母细胞中进行inside-out patch体外膜片钳实验,测试了mSlo1(不含STREXe9alt)、STREX-1STREX-2STREX-1-e9altSTREX-2-e9alt的电压依赖性和Ca2+敏感性。结果显示,STREX-20 [Ca2+]i条件下使BK通道的电压半激活值(Vh)产生了约50 mV的负向移动,而STREX-1在相同条件下并没有产生Vh的移动。有趣的是,STREX-1-e9altSTREX-2-e9alt0 [Ca2+]i条件下Vh都产生了50 mV的负向移动。


2. STREXexon 9al变构体对BK通道激活特性的影响


由于IHCs可将声波产生的机械力转换为电信号,作者进一步测试了机械力是否影响STREX-1STREX-1-e9altSTREX-2STREX-2-e9alt的激活。结果发现,60 mmHg的机械拉伸可以在0 [Ca2+]i条件下均可使STREX-1STREX-1-e9altG-V曲线产生明显负向位移,表明机械力和e9altBK通道具有叠加的激活效应。


3. 机械力对STREX-1STREX-1-e9alt变构体激活特性的影响


STREX-2STREX-2-e9alt中有相似效果,但是该叠加效应相对较弱。此外,由于LRRC52亚基已被证明在IHCs中表达,因此确定在生理条件下α亚基和LRRC52共表达时,机械力介导的G-V位移是否得以维持就显得尤为重要。


4. 机械力对STREX-2STREX-2-e9alt变构体激活特性的影响


接下来作者进一步检查了当这些变构体与LRRC52亚基共表达时,机械力对G-V曲线位移的影响。结果显示LRRC52在所有变构体的G-V曲线上都产生了负向位移


5. LRRC52亚基共表达对STREX-1 STREX-1-e9altSTREX-2STREX-2-e9alt通道激活的影响


并且当与LRRC52共表达时,机械力仍然在STREX-1 STREX-1-e9altSTREX-2+LRRC52STREX-2-e9alt+LRRC5通道的G-V曲线上产生额外的负向位移。作者发现,在所有测试的[Ca2+]i浓度下,60 mmHg的机械力在STREX-2-e9alt + LRRC52中产生大约30 mVVh负向移动,导致在0 [Ca2+]i条件下Vh约为27 mV,这接近于在IHCs中进行inside-out膜片钳测试中得到的Vh值。


6. 机械力导致与LRRC52亚单位共表达的STREX-2STREX-2-e9alt变构体的Vh进一步负向移动。


为了比较0 [Ca2+]i条件下IHCsBK通道与卵母细胞中BK变构体的G-V曲线,作者使用Whole-cell膜片钳记录了IHCs中原始BK通道的电流Vh-20 mV左右,表明在0 [Ca2+]i条件下克隆的变构体的Vh仍比通过全细胞记录的IHCs BK通道的Vh更正。


7. KCNMA1 CKO小鼠IHCs中的BK电流缺失


尽管BK电流是耳蜗IHCs中的主要钾电流,但BK通道在听觉感知中的作用仍然是一个有争议的话题。为了研究这问题,作者使用特异性敲除IHCsBK通道的小鼠进行ABR测试。结果显示小鼠的ABR阈值在所有测试频率上均显著高于对照组小鼠,表明BK通道在维持正常的耳蜗功能中扮演着关键角色。


8. KCNMA1 CKO小鼠耳蜗功能异常


文章结论与讨论,启发与展望
本研究结合膜片钳电生理、免疫组化和转基因小鼠及统计学等多种手段,阐明了机械力、Slo1 α亚基的特殊变构体和LRRC52在形成IHCsBK通道独特生物物理特性中的作用,并揭示了BK通道在调节听觉感知中的基本作用。

该研究存在以下局限性:首先,作者通过计算发现在基底部的IHC纤毛上可能达到的有效压力高达3000 Kpa,这比在非洲爪蟾膜上施加的最高机械力(60 mmHg)高出375倍,因为更高的压力往往会破坏细胞膜片,从而导致得到的结果无法更接近于生理状态下IHCsBK通道的Vh值。其次,尽管本研究解释了机械敏感变构体STREX在维持IHCsBK通道独特的生物物理特性的作用,但是实验中使用到的条件性敲除小鼠不能用来评估STREX在听力损失中的作用,这需要新的小鼠模型来进行进一步探究。

原文链接:https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0021925824024724

通讯作者:乔月华,耳鼻喉科学科带头人,徐州市听觉和平衡医学重点实验室主任,江苏省六大人才高峰高层次人才资助对象。国家自然科学基金1项,省卫生厅课题30余篇,其中SCI收录,影响因子累计超过6部。获得专利1项,教育部科技成果奖1项,徐州市科技进步二等奖2项。


通讯作者:唐琼瑶Ph.D.,徐州医科大学麻醉学重点实验室教授、博导、江苏特聘教授。主要研究方向:疼痛和癫痫相关离子通道的作用及其机制研究。近年来以通讯作者在Cell ReportsJournal of biological chemistry, ACS Chemical Neuroscience等国际期刊发表多篇科研论文。


通讯作者:张赭Ph.D.,徐州医科大学麻醉学重点实验室教授、博导、江苏特聘教授。主要研究方向:研究离子通道,尤其是钾离子和氯离子通道的门控机制、生物物理和药理学特性及其在疼痛、癫痫、焦虑和麻醉中的作用机制。研究参与全身麻醉的神经核团和相关环路及离子通道基础。近年来以通讯作者在Cell Reports, Journal of Neuroscience, Journal of Biological Chemistry, British Journal of Pharmacology等国际期刊发表多篇科研论文。


第一作者:沈中山,徐州医科大学麻醉学重点实验室博士研究生。主要研究方向离子通道与疾病。近年来以第一作者(含共一)在Journal of Neuroscience, Journal of Biological Chemistry等杂志发表多篇论文。


该研究得到了国家自然科学基金面上项目、江苏省特聘教授、江苏高校重点项目、江苏省科技厅团队项目、徐州市基础科研项目的支持。


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参考文献
[1]ANCATEN-GONZALEZ C, SEGURA I, ALVARADO-SANCHEZ R, et al. Ca(2+)- and Voltage-Activated K(+) (BK) Channels in the Nervous System: One Gene, a Myriad of Physiological Functions [J]. Int J Mol Sci, 2023, 24(4).

[2]FILIPIS L, BLOMER L A, MONTNACH J, et al. Nav1.2 and BK channel interaction shapes the action potential in the axon initial segment [J]. J Physiol, 2023, 601(10): 1957-79.

[3]MYSIEWICZ S C, HAWKS S M, BUKIYA A N, et al. Differential Functional Contribution of BK Channel Subunits to Aldosterone-Induced Channel Activation in Vascular Smooth Muscle and Eventual Cerebral Artery Dilation [J]. Int J Mol Sci, 2023, 24(10).

[4]BUTLER A, TSUNODA S, MCCOBB D P, et al. mSlo, a complex mouse gene encoding "maxi" calcium-activated potassium channels [J]. Science, 1993, 261(5118): 221-4.

[5]PYOTT S J, DUNCAN R K. BK Channels in the Vertebrate Inner Ear [J]. Int Rev Neurobiol, 2016, 128: 369-99.

[6]THURM H, FAKLER B, OLIVER D. Ca2+-independent activation of BKCa channels at negative potentials in mammalian inner hair cells [J]. J Physiol, 2005, 569(Pt 1): 137-51.

[7]LINGLE C J, MARTINEZ-ESPINOSA P L, YANG-HOOD A, et al. LRRC52 regulates BK channel function and localization in mouse cochlear inner hair cells [J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2019, 116(37): 18397-403.

[8]SAKAI Y, HARVEY M, SOKOLOWSKI B. Identification and quantification of full-length BK channel variants in the developing mouse cochlea [J]. J Neurosci Res, 2011, 89(11): 1747-60.

[9]TANG Q Y, QI Z, NARUSE K, et al. Characterization of a functionally expressed stretch-activated BKca channel cloned from chick ventricular myocytes [J]. J Membr Biol, 2003, 196(3): 185-200.

[10]NIU X, QIAN X, MAGLEBY K L. Linker-gating ring complex as passive spring and Ca(2+)-dependent machine for a voltage- and Ca(2+)-activated potassium channel [J]. Neuron, 2004, 42(5): 745-56.

[11]RUTTIGER L, SAUSBIER M, ZIMMERMANN U, et al. Deletion of the Ca2+-activated potassium (BK) alpha-subunit but not the BKbeta1-subunit leads to progressive hearing loss [J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2004, 101(35): 12922-7.

[12]PYOTT S J, MEREDITH A L, FODOR A A, et al. Cochlear function in mice lacking the BK channel alpha, beta1, or beta4 subunits [J]. J Biol Chem, 2007, 282(5): 3312-24.

编辑︱王思珍
本文完


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