之前我们提到光的亮度会影响近视发展，本期我们继续分享神奇的光在视光领域的研究，本篇探究光照强度与近视、视网膜中多巴胺及其代谢的关系，属于基础领域研究内容，内容稍微复杂写，可以下载原文学习。这篇论文于2021年发表在IOVS（一区），DOI：10.1167/iovs.62.1.28供大家检索。（点击文末“阅读原文”，查看原文）
一、研究背景
已有研究表明户外活动时间长、接触强光的儿童近视可能性低，动物实验也证实明亮环境光对近视有保护作用，但也有研究未发现强光益处，故何种光环境有益尚不明晰。视网膜能适应不同光条件，以往认为视锥细胞驱动屈光发育，但现有数据显示视杆细胞也有贡献，且视网膜多巴胺（DA）被视作近视发展的关键信号分子，其水平随光照变化，但具体机制不清。因此，本研究利用小鼠模型探究不同环境光照对近视的影响及多巴胺信号传导机制。
二、实验方法
动物与实验设计：23日龄雄性C57BL/6J小鼠，分别置于暗视（1.6×10-3 cd/m2）、中间视觉（1.6×101 cd/m2）和明视（4.7×103 cd/m2）12:12光/暗循环环境中，各环境小鼠数量相近。提供充足食物和水，笼子特殊设计防阴影，实验全程监测小鼠。
光照暴露：用定制光箱（暗视和中间视）和商业面板（明视）提供光照，通过光度计和分光光度计测量笼内光强度与光谱，维持环境温度正常。除测量外，小鼠持续处于指定光照，部分P28小鼠急性暴露3小时后采集视网膜分析，见图1。
图1.研究的实验设计
屈光和眼部测量：在P23、28、35日龄按标准流程测量小鼠屈光和眼部参数。用1%托吡卡胺散瞳后，用自制仪测屈光不正，排除双眼屈光差大于2.5D的弱视小鼠；用自制角膜曲率计测角膜曲率；用光学相干断层扫描系统获取眼部图像，测眼轴长度等参数，测试后用育亨宾促进小鼠恢复，部分低质量图像不用于分析。对部分小鼠右眼施加-10D离焦镜片以诱导近视，左眼作对照，每日检查戴镜情况。
视网膜样本采集与分析：
1. 多巴胺检测：长时程实验中，38日龄时处死小鼠，取视网膜，于光照开始4-6小时后采集，立即冻存。用高效液相色谱（HPLC）分析视网膜多巴胺（DA）及其代谢物3,4-二羟基苯乙酸（DOPAC）水平，样本经处理后注入色谱柱，根据保留时间和外标对比确定峰，结果用Lowry法测的总蛋白含量归一化。
2. 基因表达分析：取各光照组对照和LIM处理小鼠视网膜，用RLT缓冲液匀浆，提取RNA并反转录为cDNA，用数字微滴聚合酶链反应（ddPCR）测多巴胺相关蛋白（TH、VMAT2、DAT、MAO-A、MAO-B）基因表达，用特定探针和分析软件计算转录本相对量，见表1。
3. 蛋白质印迹检测：取光照开始4-6小时后的视网膜，用RIPA缓冲液匀浆，用BCA法归一化蛋白浓度后电泳、转膜，用特异性一抗和二抗孵育，化学发光成像，用软件分析条带强度，以α-微管蛋白为内参，将数据与中间视觉对照组归一化，见表2。
表1.ddPCR分析DA动力学相关基因时使用的探针
表2.用于测量视网膜组织中 DA 相关蛋白的抗体
统计分析
用ANOVA及Holm Sidak事后检验比较不同组间屈光不正、眼部参数、多巴胺及相关指标。以镜片处理眼与对侧眼屈光差衡量近视转移，用Pearson相关分析部分小鼠屈光与眼轴长度关系，显著性设为α=0.05，数据以均值±标准误表示。
三、研究结果
不同光照对近视转移的影响：见图2，暗视和明视光照下，镜片诱导近视小鼠的近视转移（-1.62±0.37D和-1.74±0.44D）显著小于中间视觉光照组（-3.61±0.50D），暗视与明视组间无显著差异，对照组各光照组屈光发育无不同，且对照组眼与对侧眼无显著差异。
图2.暗视和明视光照可抑制小鼠镜片诱导的近视。（A）饲养在暗视（黑线）、中间视（蓝线）或明视（橙线）光下的对照小鼠表现出相同的屈光不正发展。（B）暴露于中间视觉光照的镜片诱导小鼠在P35时的近视变化大于暴露于暗视或明视光的小鼠（单向方差分析 F(2,58)=6.50；P<0.01）。n= 17~21/镜片诱导组，事后比较用**P<0.01表示。
中间视觉光照对眼部参数的影响：见图3，在对照眼和镜片处理眼中，中间视觉光照组小鼠屈光不正与眼轴长度相关性不同于暗视和明视组。对照眼中，各光照组二者呈正相关，但中间视觉组相关系数不同；镜片诱导眼中，中间视觉组呈负相关，暗视和明视组相关性不显著。见图4，中间视觉组镜片处理眼角膜曲率随年龄和镜片离焦的增加而显著变陡，暗视和明视组无此变化，其他眼部参数在各对照组无显著差异。
图3.对照组和中间视觉组镜片诱导小鼠的眼轴长度与屈光不正相关。（A）对照组动物在暗视（黑色）、中间视（蓝色）和明视（橙色）光下，P28和P35天的眼轴长度与屈光不正呈正相关。（B）经过镜片离焦处理，无论是在暗视还是明视光下饲养的小鼠，在接受镜片诱导的眼睛中，P28和P35天的眼轴长度与屈光不正呈不显著的正相关。然而，中间视觉光照导致屈光不正和眼轴长度呈负相关，表明更多的近视与轴长相关。n=在两个时间点用于分析的眼睛数量；两图仅显示右眼。
图4.接受中间视觉光照射的镜片处理使角膜曲率变陡。（A）暗视光下饲养的小鼠的角膜曲率不会因镜片处理而改变，但会随着年龄的增长而增加。（B）在中间视觉光下，接受镜片处理的眼睛在P35时角膜曲率最低。（C）明视光下饲养的小鼠的角膜曲率会随着年龄的增长而增加，但不会因镜片处理而改变。对照眼以黑线表示，未接受过镜片处理的左眼以红色虚线表示，接受过镜片处理的左眼以红色实线表示。
视网膜多巴胺水平与代谢：如图5，各光照组内，对照组和镜片处理组的DOPAC、DA及DOPAC/DA比值无显著差异，但整体上DOPAC水平随光照增强而升高，DA水平稳定，DOPAC/DA比值在明视光照下最高，表明多巴胺代谢随光照增强而增加。
图5.DA随照度水平的增加而增加。在每个笼子照度水平下，光照开始后4到6小时收集视网膜。（A）在约2周的环境光暴露后，两个治疗组的DOPAC水平随着光照强度的增加而增加。对于两个治疗组，所有光照水平组的DOPAC水平均有显著差异。（B）没有一个治疗组因光照或镜片散焦而出现DA水平变化。（C）DOPAC/DA比随光线的增加而增加，表明在较高光照强度下DA代谢较高。对于两个治疗组，所有光照水平组的DOPAC/DA比率均有显著差异。暗视样本用黑色圆圈表示，中视样本用蓝色方块表示，明视样本用橙色三角表示。
光照与镜片处理对多巴胺相关基因和蛋白的影响:
1. 基因表达：见图6，表达受光照和镜片处理的相互作用，对照组明视高于暗视，镜片处理组中间视觉最高；Slc18a2和Slc6a3表达无组间差异；Maoa在镜片处理眼表达高于对照眼，Maob无变化。
图6.与DA信号传导相关的基因表达。在光照和 镜片诱导后使用ddPCR测量DA信号传导基因的表达水平。（A）多巴胺能细胞中的DA信号传导依赖于酪氨酸羟化酶和其他几种相关蛋白来严格控制DA及其代谢物DOPAC的水平。（B）在对照小鼠中，与暗视小鼠相比，在明视光下饲养的小鼠的Th表达明显更高。在中间视觉光下，镜片离焦处理的视网膜的Th表达明显高于镜片处理的明视视网膜。（C、D）Slc6a3（DAT）或 Slc18a2（VMAT2）的表达无显著差异。(E)LIM 眼 Maoa表达水平显著高于对照眼，(F)Maob表达不随镜片或光处理而改变。以任意单位测量，标准化为HPRT水平。暗视样本用黑色圆圈表示，中视样本用蓝色方块表示，明视样本用橙色三角表示。对于事后比较，*P<0.05。
2. 蛋白水平：见图7，TH蛋白水平无显著差异，但有暗视和明视下镜片处理降低、中间视下可能升高的趋势；在对照眼中稳定，镜片处理后随光照增强而降低；TH磷酸化与总水平比值无组间差异；VMAT2蛋白水平不受影响。
图7.随环境光的增加，镜片处理组下的磷酸化TH降低。（A）TH水平不会随环境光或LIM而发生显著变化。（B）磷酸化TH、pTHSer40与光强度呈负相关。这种影响可能是由于与所有光照水平下对照视网膜中等效pTHSer40相比，在明视光下（橙色三角）镜片散焦治疗的视网膜中pTHSer40水平降低所致。（C）在每个光照水平下，对照和镜片散焦视网膜之间的pTHSer40与总TH的比率均显示无显著关系。为限制样本数量，本分析仅使用用于TH和pTHSer40标记的视网膜。（D）VMAT2蛋白水平不受光线或镜片散焦处理的显著影响。代表性印迹包含在补充图S4中。
急性光照对多巴胺活性的影响：见图8，急性暴露3小时后，明视光照下视网膜DOPAC水平最高，暗视下DA水平最高，DOPAC/DA比值随光照增强而增加。ddPCR检测未发现Th、Slc18a2、Slc6a3表达在不同光照组有显著差异，但有随光照增强而升高的趋势。
图8.急性明视光照会导致DA活性升高。（A）暴露于暗视（黑色圆圈，n=5~7）、中视（蓝色方块，n=5~10）或明视（橙色三角，n=5~9）光3小时的视网膜中DOPAC水平表明短时间暴露期间在强光下DA代谢增加。（B）暗视光下DA最高。（C）代表DA活性的DOPAC/DA比率在暗视暴露的视网膜中最低，在明视光下最高。(D)Th、(E)Slc18a2、(F)Slc6a3的基因表达在不同光照水平下没有显著差异。事后比较显示，**P<0.01，***P<0.001。
四、讨论
中间视觉光增加近视易感性的机制：中间视觉光下近视转移大且眼部参数改变，可能因该光照激活视杆-视锥通路的视网膜回路与暗视、明视不同，影响多巴胺活性。中间视觉可能类似黄昏时视网膜细胞电耦合增强，干扰多巴胺等信号分子释放，尽管多巴胺合成和储存增加，但可能降解快或未有效结合受体，无法抑制眼轴增长。
不同光照检测的视网膜信号通路：如图9，暗视光激活视杆通路，中间视觉光激活视杆-视锥通路，明视光刺激视锥细胞，视觉系统借此适应不同光强。视杆通路在屈光发育中有重要作用，如周边视网膜远视离焦可诱导近视，视杆细胞敲除小鼠屈光发育异常，且视杆细胞与多巴胺释放相关。明视光可能刺激黑素视蛋白视网膜神经节细胞（mRGCs），其在近视发展中的作用尚待研究。
图9.光感受器的光敏感度。人类光感受器对自然光和人造光的敏感度范围很广。暗视光低于视锥细胞的激活阈值，中视光可激活视杆细胞和视锥细胞，明视光可激活视锥细胞。最近的研究表明，视网膜神经节细胞(mRGC)和视杆细胞在明视光中具有潜在作用。这些实验中使用的照度水平用黑色箭头表示。
环境光照与眼部参数变化关系：小鼠眼小，检测眼轴长度变化需高灵敏度技术。正常小鼠眼轴随年龄增长与屈光不正呈正相关，镜片诱导近视后，中间视觉组呈负相关，暗视和明视组相关性不显著，表明暗视和明视光下近视转移小，眼轴伸长少。角膜曲率在中间视觉镜片处理眼显著变陡，可能加重近视。
小鼠近视模型中的多巴胺信号传导：虽然视网膜DA和DOPAC水平在镜片处理与对照眼无差异，但多证据支持DA参与小鼠近视发展。本研究发现光照和镜片处理改变多巴胺相关基因和蛋白表达模式，如中间视觉镜片处理眼Tb表达和 VMAT2有增加趋势，pTHSer40显著降低，表明镜片离焦与光照相互作用影响DA活性，且与视网膜细胞间耦合模式相关，不同多巴胺受体活性可能影响屈光发育。
短长期光照下多巴胺稳态：长期光照下，明视光使视网膜DA释放和降解增加，DA合成与代谢达稳态；急性暴露时，明视光下DA代谢快但合成未及时增加，暗视光下DA水平高。实验前让小鼠适应光照虽未改变屈光不正，但可能影响DA信号水平，其对后续近视发展的影响及暗视和明视光保护作用机制需进一步研究。
临床意义：研究表明环境中广泛光环境影响近视发展，儿童处于中间视觉或室内光环境时间长可能增加近视风险，增加对屈光发育和近视机制的理解有助于开发防治方法。
五、研究总结
本研究揭示了不同环境光照对小鼠近视易感性和视网膜多巴胺信号传导的重要影响。暗视和明视光照可减轻镜片诱导的近视，中间视觉光则增加近视风险，其机制与光照激活的视网膜通路及多巴胺活性变化有关。研究结果为深入理解近视发病机制提供了重要依据，也为近视防治策略的制定提供了新的思路，未来需进一步探究相关机制及潜在治疗靶点。
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