巩膜缺氧学说是近视发生发展的机制之一，所以理论上可以认为任何干预巩膜重塑的物质都可以成为近视防控的利器。而我国传统中医药跨越千年，内容巨大，其在眼视光医学领域的应用少之又少。接下来这篇基础医学研究论文，从动物活体实验出发，探究在近视诱导过程中，中草药有效成分槲皮素对巩膜重塑的作用。由于是基础研究，有一定的阅读难度，小铂建议没有科研基础的学者们可以跳过材料与方法中的后半部分、跳过结果中的数据和图表。论文很新，来自山东中医药大学，于2024年末发表在IOVS（医学二区）。推文内容全面但简洁，如您需要，可以点击文末的”阅读原文”以下载原文学习。
一、研究背景
巩膜，一种坚韧且结构复杂的结缔组织，主要由富含胶原和弹性纤维的致密结缔组织构成，其厚度在眼球不同部位有所差异，后极部最厚，约1.0-1.3mm，肌腱附着处最薄，约0.3mm。在近视发展过程中，巩膜重塑是重要环节，表现为胶原纤维降解、重排，巩膜变薄，眼轴增长。
基质金属蛋白酶-2（MMP-2）可降解细胞外基质成分，在组织重塑中起关键作用，其天然抑制剂TIMP-2能与之结合调节其活性，胶原蛋白I则是提供组织支撑的重要细胞外基质成分，三者在巩膜重塑过程中相互作用。近年来发现，PERK-EIF2α信号通路参与细胞应激反应及细胞生长、分化和凋亡的调控，在巩膜重塑过程中，该通路的激活被认为是胶原纤维降解的重要机制之一，抑制此通路可能成为治疗近视的新策略。
槲皮素是一种天然存在于多种植物中的黄酮类化合物，具有抗氧化、抗肿瘤等多种生物活性，其在抑制细胞应激反应方面的潜力备受关注，但能否通过抑制PERK-EIF2α信号通路改善巩膜重塑进而减缓近视进展尚未得到系统研究。豚鼠因能有效模拟眼轴伸长和屈光变化，成为近视研究的理想动物模型。
二、材料与方法
实验动物：120只2周龄健康三色豚鼠，体重140±10g，实验前经眼部参数评估排除眼部疾病，并获山东中医药大学附属医院实验动物伦理审查委员会批准（批准号：AWE-2022-055）。
药物与试剂：槲皮素购自MCE（Med Chem Express），化学结构见图1.用DMSO溶解后配制成3mg/mL工作液，按50mg/kg剂量腹腔注射豚鼠。
图1.槲皮素的化学结构式。
实验分组与干预：随机分4组，每组30只：正常对照（NC）组正常饲养无干预、右眼-6D镜片诱导近视（LIM）组、LIM+假干预（SHAM）组腹腔注射生理盐水、LIM+槲皮素干预（QUE）组腹腔注射槲皮素悬浮液。生理盐水注射量100μL/kg，槲皮素注射量50mg/kg，每日检查镜片确保造模有效。
眼部参数测量：诱导4、6周后，移除镜片，用0.5%复方托吡卡胺滴眼液散瞳，德国 Striatech GmbH生产的 photorefractor 测量屈光度，每眼至少测6次取均值；用法国Quantel Medical 眼科A超（Cinescan）测量眼轴长度，测量前结膜囊滴入0.4%盐酸奥布卡因滴眼液麻醉，探头频率11MHz，依文献设置超声传播速度，记录10次读数取平均值。
分子对接：通过网络药理学构建槲皮素靶标网络，分析其与PERK、EIF2α的关系，利用数据库确定潜在靶点，用STITCH验证相互作用，KEGG和STRING提供信号通路和蛋白质-蛋白质相互作用信息，Cytoscape可视化网络。获取 PERK（PDB ID: 4Y7H）和 EIF2α（PDB ID: 1RZ4）3D结构及槲皮素（CID: 5280343）结构并预处理，用AutoDock Vina分子对接，分析结合能、氢键和疏水相互作用确定结合模式。
组织染色与检测：诱导4、6周后每组选3只豚鼠，分离巩膜。部分巩膜用4%多聚甲醛固定，常规处理后进行Masson染色和免疫组化染色（PERK、EIF2α、MMP-2、TIMP-2、胶原蛋白I），光镜观察，ImageJ软件分析图像。另取部分巩膜组织，分离后用冷PBS处理，切成小块，消化后用Biyuntian ROS试剂盒检测活性氧（ROS）水平，流式细胞仪分析；用无创微测技术（NMT）测量钙离子流量。
基因与蛋白表达检测：诱导4、6周后每组取5个巩膜组织，液氮速冻后-80°C保存。提总RNA，逆转录得cDNA，qPCR检测PERK、EIF2α、MMP-2、TIMP-2、胶原蛋白I基因表达。WB检测相关蛋白表达，还用免疫共沉淀技术分析PERK和EIF2α相互作用，巩膜细胞裂解后离心取上清，与抗PERK抗体和Protein A/G琼脂糖磁珠孵育，洗涤洗脱后SDS-PAGE和免疫印迹分析。
统计分析：用SPSS Statistics 23.0软件，配对t检验比较不同时间点眼内屈光参数，独立样本t检验比较实验（LIM）组与NC组右眼参数及基因表达差异。
三、研究结果
屈光度和眼轴长度变化：如图2，诱导前各组豚鼠屈光度和眼轴长度无显著差异。诱导4、6周后，LIM组和LIM+SHAM组较NC组近视屈光度降低、眼轴显著增长，且随诱导时间延长，双眼屈光度和眼轴长度增加；与LIM组相比，LIM+QUE组右眼屈光度和眼轴长度显著降低，LIM+SHAM组无显著差异。
图2.0、4和6周时NC、LIM、LIM+SHAM和LIM+QUE组豚鼠右眼轴长(A)和屈光度(B)的比较。将LIM组与NC组以及LIM+SHAM组进行了比较（****P<0.0001和***P<0.001）。
免疫共沉淀和分子对接结果：
免疫共沉淀证实PERK和EIF2α存在直接蛋白-蛋白相互作用。分子对接显示槲皮素与PERK结合能为-7.3 kcal/mol、与EIF2α为-7.4kcal/mol，表明结合亲和力强，见图3。
图3.(A)已知相互作用：化合物与蛋白质的ASP164、ASN167、LYS169和ILE170形成氢键相互作用，与LYS162形成Pi-烷基相互作用。(B)已知相互作用：化合物与蛋白质的GLY215、GLU194和GLY193形成氢键相互作用，与GLU194形成Pi-阴离子相互作用，与GLU194形成Pi-Sigma相互作用，与ALA189形成Pi-烷基相互作用。(C)CO-IP检测PERK和EIF2α之间的直接相互作用。(D)STRING预测PERK与EIF2α(EIF2S1)相互作用。
槲皮素对实验性近视巩膜组织内质网应激的影响：
如图4，qPCR和WB检测发现，诱导近视后LIM和LIM+SHAM组巩膜PERK、EIF2α mRNA和蛋白相对表达量较NC组显著升高，槲皮素处理后，LIM+QU组较LIM组显著降低。免疫荧光也证实近视豚鼠巩膜组织中PERK、EIF2α表达升高，见图5。此外，诱导近视后LIM和LIM+SHAM组钙离子释放增加、内质网（ER）水平升高，槲皮素处理后二者均降低，表明槲皮素可缓解实验性近视巩膜组织内质网应激，见图6。
图4.使用qPCR定量NC、LIM、LIM + SHAM和LIM+QUE组豚鼠巩膜中PERK（A、B）和EIF2α（C、D）基因的mRNA水平。对PERK和EIF2α（E、F）进行蛋白质印迹分析，以β-actin为内参。在NC、LIM、LIM+SHAM和LIM+QUE组豚鼠巩膜靶蛋白PERK和EIF2α（G-J）的相对水平在4周和6周时进行评估。将LIM组与NC组以及LIM+SHAM组进行了比较（***P<0.001、**P<0.01和*P<0.05；n=6）。
图5.免疫荧光显示巩膜组织中PERK(A)、EIF2α(B) 的表达水平。放大40倍。通过免疫荧光测量豚鼠巩膜中PERK(C、D)和Eif2α(E、F)的蛋白质水平表达。对于LIM组和NC组之间的比较，**P<0.01。对于LIM组和LIM+QUE组之间的比较（***P<0.001和*P<0.05；n=3）。
图6.近视诱导和槲皮素治疗4周和6周后的ROS和钙离子水平。我们发现LIM组豚鼠视网膜中ROS的比例、ROS和抗氧化剂的原始平衡被破坏，出现氧化应激。这种现象也出现在LIM+SHAM组中。虽然槲皮素可以有效抑制近视的发展，但与LIM组和LIM+SHAM组相比，LIM+QUE组的ROS水平下降（A）。研究结果发现，诱导4周和6周后，与NC组相比，LIM组和LIM+SHAM组的钙释放增加，槲皮素治疗后钙释放减少（B、C）。（n=3）
槲皮素对实验性近视豚鼠巩膜重塑的影响：
qPCR和WB检测显示（图7），诱导近视后LIM和LIM+SHAM组巩膜MMP-2 mRNA和蛋白表达显著高于NC组，TIMP-2、胶原蛋白I显著降低；槲皮素处理后，LIM+QUE组MMP-2表达下降，TIMP-2、胶原蛋白I升高。同时，免疫荧光也证实了上述发现，表明近视进展伴随着巩膜重塑（图8）。Masson染色和H&E染色显示（图9），NC组巩膜胶原纤维排列紧密、结构均匀，细胞染色正常；LIM和LIM+SHAM组巩膜变薄，胶原纤维排列疏松、间隙增大；LIM+QUE组胶原纤维排列紧密、间隙缩小，巩膜厚度增加，表明槲皮素可改善巩膜重塑。
图7.在第4周和第6周，通过qPCR评估NC、LIM、LIM+SHAM和LIM+QUE组豚鼠巩膜中胶原蛋白I (A)、TIMP-2(B) 和 MMP-2(C) 基因的mRNA水平。对胶原蛋白I、TIMP-2和MMP-2(D) 进行WB分析，以β-actin作为内部参考。在第4周和第6周，在NC、LIM、LIM+SHAM和LIM+QUE组中评估豚鼠巩膜靶蛋白胶原蛋白I、TIMP-2和MMP-2(E-G)的相对水平。将LIM组与NC组和LIM+SHAM组进行比较（***P<0.001、**P<0.01和*P<0.05；n=6）。
图8.免疫荧光显示巩膜组织中胶原蛋白I(A、D、E)、TIMP-2(B、F、G)和MMP-2(C、H、I)的表达水平。放大40倍。将LIM组与NC组和LIM+SHAM组进行比较（***P<0.001、**P<0.01和*P<0.05；n=3）。
图9.眼部组织切片Masson（A）和H&E染色（B）显示4周和6周（n=3）豚鼠巩膜的组织病理学特征。结果显示，NC组巩膜胶原纤维排列均匀、紧密，LIM组巩膜胶原纤维排列松散、间隙增大，LIM+QUE组巩膜胶原纤维排列紧密、间隙小于LIM组。
四、讨论
近视发生发展过程中，PERK-EIF2α信号通路被激活，参与巩膜重塑，破坏巩膜正常生理功能。内质网应激是细胞应对内外环境压力的保护反应，与钙稳态、ROS水平密切相关，三者形成复杂调节网络，在近视进展中起重要作用。
槲皮素具有抗氧化和调节内质网应激反应等作用，可通过清除自由基、调节钙泵和通道、激活内质网应激关键传感器等途径减轻内质网应激，在代谢疾病、阿尔茨海默病等方面已展现出一定治疗潜力，在眼科领域也受到关注。
本研究中，LIM组和LIM+SHAM组诱导近视后PERK、EIF2α表达升高，提示内质网应激在近视发展中起重要作用。槲皮素干预抑制PERK激活，减少EIF2α磷酸化，干扰未折叠蛋白反应，缓解巩膜细胞应激，防止纤维化和过度重塑，可能成为近视防治潜在药物（见图10的信号通路图）。
MMP-2、TIMP-2和胶原蛋白I在巩膜重塑中起关键作用，MMP-2降解细胞外基质，TIMP-2抑制其活性，胶原蛋白I提供支撑。本研究结果与以往研究一致，表明槲皮素可调节MMP-2和TIMP-2平衡，减少胶原蛋白I降解，增强巩膜机械强度，改善巩膜重塑。
图10.说明槲皮素和基于活性氧的内质网应激介导的巩膜重塑通过PERK-EIF2α信号通路的作用。
五、研究结论
巩膜重塑在近视发展中起关键作用，内质网应激、胶原代谢失衡和成纤维细胞功能异常是主要机制。槲皮素通过抑制PERK-EIF2α通路、调节MMP-2和TIMP-2平衡、保护胶原蛋白I结构等多种机制显著改善近视豚鼠巩膜重塑，但临床应用仍需进一步研究。未来应探究不同剂量、治疗时间及与其他治疗的协同作用，为近视患者提供新治疗方案。
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